Usmerjanje katepsina B s cikloastragenolom poveča protitumorsko imunost CD8 T celic z zaviranjem razgradnje MHC-I 1. del

POVZETEK

OzadjeIzguba tumorskih antigenov in izčrpavanje CD8 T celic, ki ju povzroči pot PD-1/PD-L1, sta pomembna dejavnika za imunski pobeg tumorja. V zadnjih letih je vse več raziskav tradicionalne kitajske medicine pri zdravljenju tumorjev. Ugotovljeno je bilo, da ima cikloastragenol (CAG), učinkovita aktivna molekula v Astragalus membranaceus, protivirusne, proti staranju, protivnetne in druge funkcije. Vendar njegov protitumorski učinek in mehanizem nista jasna.

Glikozid cistanche lahko tudi poveča aktivnost SOD v srčnem in jetrnem tkivu ter znatno zmanjša vsebnost lipofuscina in MDA v vsakem tkivu, učinkovito lovi različne reaktivne kisikove radikale (OH-, H₂O₂ itd.) in ščiti pred povzročeno poškodbo DNK z OH-radikali. Cistanche feniletanoidni glikozidi imajo močno sposobnost lovljenja prostih radikalov, večjo redukcijsko sposobnost kot vitamin C, izboljšajo aktivnost SOD v suspenziji semenčic, zmanjšajo vsebnost MDA in imajo določen zaščitni učinek na delovanje membrane semenčic. Cistanche polisaharidi lahko povečajo aktivnost SOD in GSH-Px v eritrocitih in pljučnem tkivu eksperimentalno starajočih se miši, ki jih povzroča D-galaktoza, pa tudi zmanjšajo vsebnost MDA in kolagena v pljučih in plazmi ter povečajo vsebnost elastina. dober čistilni učinek na DPPH, podaljša čas hipoksije pri starajočih miših, izboljša aktivnost SOD v serumu in upočasni fiziološko degeneracijo pljuč pri eksperimentalno starajočih se miših. Pri celični morfološki degeneraciji so poskusi pokazali, da ima Cistanche dobro antioksidativno sposobnost in ima potencial, da postane zdravilo za preprečevanje in zdravljenje bolezni staranja kože. Hkrati ima ehinakozid v Cistanche pomembno sposobnost čiščenja prostih radikalov DPPH in ima sposobnost čiščenja reaktivnih kisikovih vrst ter preprečuje razgradnjo kolagena, ki jo povzročijo prosti radikali, ima pa tudi dober učinek popravljanja na poškodbe anionov prostih radikalov timina.

Kliknite prednosti in slabosti cistanche

【Za več informacij:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

MetodeProtitumorski učinek CAG je bil raziskan na modelih tumorjev, presajenih pri miših MC38 in CT26. Protitumorski učinek CAG je bil nadalje analiziran z enoceličnim multi-omičnim sekvenciranjem. Ciljno odzivna tehnologija profiliranja dostopnosti je bila uporabljena za iskanje ciljnega proteina CAG. Kasneje so protitumorski mehanizem CAG raziskali z uporabo konfokalne mikroskopije, imunoprecipitacije in transfekcije mutantnih plazmidov. Na koncu so raziskali kombinirani protitumorski učinek protiteles CAG in PD-1 pri miših ali organoidih.

RezultatiUgotovili smo, da CAG učinkovito zavira rast tumorja in vivo. Naš enocelični multi-omični atlas je pokazal, da CAG spodbuja predstavitev antigenov na površini tumorskih celic in je zanj značilna okrepljena funkcija ubijanja celic CD8 in T. Mehansko gledano se je CAG vezal na svoj ciljni protein katepsin B, ki je nato zaviral lizosomsko razgradnjo glavnega histokompatibilnega kompleksa I (MHC-I) in spodbujal agregat n MHC-I na celično membrano, kar je povečalo predhodno postajo tumorskega antigena . Medtem je kombinacija CAG s protitelesom PD-1 učinkovito povečala ubijanje tumorjev, ki uničujejo tumorje CD8 plus celice T pri miših s ksenograftom in organoidih kolorektalnega raka. Zaključek Naši podatki so prvič poročali, da znižana regulacija katepsina B daje protitumorsko imunost in izkorišča protitumorski mehanizem naravnega izdelka CAG.

UVOD

Kolorektalni rak je eden najpogostejših rakov na svetu. Stopnja incidence in stopnja umrljivosti se uvrščata med prve tri, ki resno ogrožajo življenje in zdravje ljudi.1 Običajne metode zdravljenja vključujejo kirurško kemoterapijo in radioterapijo, tarčna zdravila in imunoterapijo.2–4 Vendar rakave celice običajno izkazujejo izgubo površinskih antigenov in izražajo visoke ravni zaviralnih molekul, da se izognejo nadzoru imunskih celic. Da bi rešili problem imunskega pobega tumorja, so zato raziskovalci razvili zaviralce imunskih kontrolnih točk in neoantigensko terapijo za blokiranje maskiranja rakavih celic v imunske celice.5–8 Čeprav lahko zaviralci imunskih kontrolnih točk obnovijo osiromašene imunske celice, površinski antigen raka celic ni bistveno izboljšala. Zato je še posebej pomembno najti zdravila, ki lahko spodbujajo predstavitev tumorskih površinskih antigenov. Prepoznavanje rakavih celic s citotoksičnimi celicami CD8 plus T je odvisno od poti TCR/CD3/glavnega histokompatibilnega kompleksa (MHC-I). TCR sprejme antigen, ki ga prisoten protein CI membrane dendritične celice/rakaste celice, in prenese signal za tesno povezavo CD3, ki se nato razširi globlje v citoplazmo.9 10 Hkrati z aktivacijo signala CD28/B7 , se lahko celice CD8 plus T koaktivirajo, da prepoznajo in ubijejo rakave celice.11 ​​Nedavne študije so pokazale, da v procesu napredovanja tumorja lizosomi povzročijo zmanjšanje agregacije MHC-I na površini rakavih celic, kar pa ni učinkovito prisotne antigene.12 13 Liu et al so poročali, da lahko inhibicija PCSK9 prepreči razgradnjo MHC-I v lizosomih in omogoči MHC-I, da se vrne na celično membrano, da predstavi antigene.12 Zato je ponovna vzpostavitev funkcije predstavljanja antigena MHC-I je še posebej pomemben za blokiranje imunskega pobega tumorja.

Vse več študij je pokazalo, da ima uporaba aktivnih molekul tradicionalne kitajske medicine n protitumorsko intervencijo velike možnosti.14 15 Cikloastragenol (CAG) je učinkovita aktivna molekula n Astragalus membranaceus, ki deluje protivirusno, protibakterijsko, proti- vnetne in druge farmakološke učinke, vendar o njegovem protitumorskem učinku redko poročajo.16–19 V tej študiji smo ugotovili, da CAG zavira rast trans antiranih tumorjev tumorjev raka debelega črevesa. Mehanizem je v glavnem vključeval zaviranje razgradnje MHC-I, ki jo posreduje katepsin B (CTSB), ki spodbuja predstavitev antigena rakavih celic in nato poveča sposobnost ubijanja celic CD8 plus T.

MATERIALI IN METODE

Protitelesa in reagenti

CAG was obtained from Yongjian Pharmaceutical Technology (Jiangsu, China, purity >99 odstotkov). Protitelesa CTSB (Cat#12216-1-AP, PRID: AB_2086929), HLA (Cat#15240-1-AP, PRID: AB_1557426), aktin (Cat#{{ 5}}Ig, PRID: AB_2782959 ), Tubulin (Cat#10094-1-AP, PRID: AB_2210695) ​​in Komplet za odkrivanje imunohistokemije proti mišjem/zajcem (Cat#PK10006) so bili kupljeni pri Proteintechu. Protitelesa H2-Kd (Cat#sc-53852, PRID: AB_784514), LAMP1 (Cat#sc- 20011, PRID: AB_626853), in CTSB (Cat#sc-365558, PRID: AB_10842446) so bili kupljeni pri Santa Cruz Biotechnology. Protitelo Ki-67 (Cat#12202, PRID: AB_2620142) je bilo kupljeno pri Cell Signaling Technology. Protitelesa Na/K ATP-aze (Cat# ab3528, RRID: AB_303877) so bila kupljena pri Abcam. Protitelesa s pretočno citometrijo CD45-V500 (Cat#561487, RRID: AB_1069704 6), CD3-APC (Cat#345767, RRID: AB_2833003 ) in CD{ {31}}PerCP (Cat#345774, RRID: AB_2868802) so bili kupljeni pri BD Bioscience. Protitelo za pretočno citometrijo Gzmb-FITC (kataloška številka 515403, RRID: AB_2114575) je bilo kupljeno pri BioLegendu. Protitelesa pretočne citometrije NK1.1-PE-Cy7 (Cat#25-5941-81, RRID:AB_469664) in IFN- -PE (Cat#12-7311-81, RRID :AB_466192) so bili kupljeni pri Thermo Fisher Scientific. Medij DMEM (Cat#01-052-1ACS), penicilinstreptomicin (Cat#15140122) in fetalni goveji serum (Cat#C04001-500) so bili kupljeni pri Biological Industries. Kozji serum (Cat#88RNG001) in Pierce BCA testni komplet (Cat#23225) sta bila kupljena pri Thermo Fisher Scientific. Protitelesa proti humani PD-1 (Cat#BE0188, RRID: AB_1095031 8) in protitelesa proti mišji PD-1 (Cat#BE0146, RRID: AB_1094905 3) so bili kupljeni pri Bio X cell. MACS Tumor Tissue Disociation Kit (Cat#130-095-929) je bil kupljen pri Miltenyi Biotec.

Kultura celic

Mišji celični liniji raka debelega črevesa MC38 in CT26 smo vzdrževali v našem laboratoriju.20 Človeške linije raka debelega črevesa HCT-116 so bile pridobljene iz zbirke tipskih kultur Kitajske akademije znanosti (Šanghaj, Kitajska). Celice MC38, CT26 in HCT-116 smo gojili v mediju DMEM, ki je vseboval 10 odstotkov fetalnega govejega seruma in 1 odstotek penicilina/streptomicina pri 37 stopinjah v inkubatorju s 5 odstotki CO2.

Transplantacijski tumorski poskus

Šest-osem tednov stare samice miši C57BL/6JGpt, miši BALB/c in gole miši BALB/,c so bile kupljene pri GemPharmatech (Nanjing, Kitajska). Rakave celice MC38 ali CT26 (1 × 106) so bile subkutano inokulirane v vsako miško. Ko tumor zraste na 100 mm3, je bil mikrofon naključno razdeljen na skupino s fosfatnim pufrom (PBS) (npr. enkrat na dan) in skupino CAG (npr. 50 mg/kg enkrat na dan). Volumen tumorja smo določili z merjenjem s kaliperjem po formuli V=dolžinaךirina2 /2. Ko je volumen tumorja miši skupine PBS dosegel 1000 mm3, smo tumor miši vzeli ven, ga fotografirali in stehtali.

Enocelična disociacija od miši za enocelično RNA/ATACseq

Trdne tumorje iz miši smo razgradili s kompletom za disociacijo tumorjev, da smo dobili enocelične enocelične celice. Enojna celica Enocelične celice s koncentracijo 1000 celic/1000 celic, naložene na krmilnik 10×genomics chromium enocelične enocelične celice po protokolu proizvajalca 10×genomics. Reagenti za reverzno transkripcijo, gelne kroglice s črtno kodo in razdelilno olje so bili pomešani s celicami za gen, da so nastale gelne kroglice v emulzijah (GEM) za reverzno transkripcijo. scRNA-seq predprocesiranje podatkov in qua y nadzor.

Temelji na mišjem referenčnem genomu GRCm38 (mm10), cevovodu CellRanger V.4.0.0 (10×Genomics) za obdelavo enocelične RNA podatke o zaporedju za vsak poskus (GSE197229). Digitalne genske ekspresijske matrike so bile v R (V.4.0.4) z uporabo paketa Seurat (V.4.0.0).21 Pred analizo dBeforem so bile celice filtrirane po številki UMI (<100,000 UMIs), gene number (<6500 genes), and mitochondrial gene percentage ('percentage. MT'less than 10%). Normalization was performed with the SCTransform function with regression of percentage the of mitochondrial genes.22 For integration, 2000 shared highly variable genes were identified using the t SelectIntegrationFeatures function.23 Integration anchors were identified based on these genes using the FindIntegrationAnchors34 function with an'SCT'normalization method. The data were then integrated using the IntegrateData function. Principal component analysis (PCA) and t-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) dimension reduction with the top 30 principal components were performed. A nearest-neighbor graph using the 30 dimensions of the PCA reduction was calculated using FindNeighbors, followed by clustering using FindClusters with a resolution of 0.8. Candidate Marker genes for each cell cluster were identified by the FindAllMarkers function. For each cluster of cells, up-specific differentially expressed genes were identified using the Wilcoxon Rank Sum test as implemented in FindAllMarkers.

Predobdelava podatkov SeaTac-seq in nadzor kakovosti

Podatke ATAC-seq za eno celico (GSE197229) je predhodno obdelal cell ranger-at (V.2.0.0) z ukazno vrstico za štetje. Za nadaljnjo obdelavo in analizo podatkov scATAC-seq smo uporabili paket ArchR (V.1.0.1).24 Nato smo uporabili funkcijo addArchRGethe nome ('mm10') za označevanje genoma in ustvarili arrow datoteko s funkcijo cre ArrowFiles s privzetimi parametri. Nato smo s funkcijo filterDoublets izbrisali morebitne dvojnike in ustvarili projekt ArchR s funkcijo ArchRProject s privzetimi parametri. Nato smo uporabili paket Harmony za odstranitev paketnega učinka s funkcijo addHarmony.25 Za zmanjšanje dimenzionalnosti uporabljamo funkcijo addIterativeLSI v ArchR za izvajanje s parametri def t. Za vdelavo ene celice smo izbrali objekt reduceDims s harmonijo in za vizualizacijo uporabili funkcijo addTSNE s parametrom 'perplexity=30'.

Integrirana analiza podatkov siRNA-seq in scATAC-seq

To integrate scATAC-seq data with matched scRNA-seq data, we first used the FindTransferAnchors function from the Seurat package and aligned the data with the addGeneIntegrationMatrix function in ArchR with  'unconstrained integration' mode. From the result, we found that most of the predicted scores were>0.5. Da bi izboljšali natančnost napovedi za boljšo integracijo obeh naborov podatkov, smo ponovno integrirali podatke scATAC-seq in scRNA-seq z načinom 'omejene integracije'. Na kratko, podatke scATAC-seq smo označili s tipi celic na podlagi rezultatov genov scATAC-seq. Nato smo ustvarili omejeni seznam, tako da je bila podobnost izražanja genov izračunana samo v isti vrsti celice za scATAC-seq in scRNA-seq. Nenadzorovano združevanje s t-SNE je razkrilo 13 podceličnih grozdov, ki so bili označeni z znanimi ali domnevnimi označevalci v spletni dodatni tabeli 1.

Pot psevdočasovne linije

Pot celične linije rakavih celic je bila ugotovljena z uporabo paketa Monocle2 (V.2.18.0) R.26 Monociti se naučijo eksplicitnega glavnega grafa iz enoceličnih genomskih podatkov z vdelavo obrnjenega grafa za razvrščanje celic in tako rešujejo zapletene biološke procese robustno in natančno.27 Uporabili smo funkcijo ''differentialGeneTest'' za izpeljavo DEG iz vsakega grozda in po konstruiranju celične trajektorije smo zaznali diferencialno izražene gene v psevdo času. Vsi psevdo-časovno odvisni geni so bili vizualizirani s funkcijo plot_pseudotime_heatmap, ki je prevzela objekt CellDataSet. Grafi krivulj linije in gladke krivulje izražanja, ki temeljijo na CellDataSet, so bili ustvarjeni s plot_cell_trajectory oziroma plot_geni_v_psevdočasu.28

Klicanje različice številke enocelične kopije

Za identifikacijo malignih celic s klonskimi velikimi variacijami števila kromosomskih kopij (CNV) smo uporabili paket inferCNV R za sklepanje genetskih profilov vsake celice na podlagi povprečne ekspresije velikih genskih nizov v vsaki kromosomski regiji tumorskega genoma v primerjavi z normalne celice.29 Na osnovi vzorca za vzorcem so bile imunske celice uporabljene kot referenca za oceno CNV v celicah, povezanih z rakom.

Analiza obogatitve

Analize pripomb KEGG poti in GO so bile izvedene z uporabo paketa R clusterProfiler (V.3.11.1) s parametri PValueCutoff=0.05, PAdjustMethod=BH, QValueCutoff{{6} }.05, MingsSize=10 in MaxGSSize=500.20 Analiza obogatitve genskega nabora (GSEA) je bila uporabljena z uporabo 50 značilnih genskih naborov (h.all.V.7.4.symbols. gmt) za identifikacijo znatno obogatenih funkcionalne poti prek programske opreme GSEA (V.4.1.0), s presejalnimi merili nominalne P-vrednosti<0.05and false discovery rate q<0.250.30

Kvantitativna PCR analiza v realnem času

Celice MC38 in HCT-116 so bile 6 ur zasejane v plošče s šestimi jamicami in nato nadaljnjih 24 ur obdelane s CAG. Celice smo trikrat sprali s hladnim PBS in centrifugirali pri 180g 5 minut pri 4 stopinjah. Istočasno po mletju tumorskega tkiva. Celotno RNK smo ekstrahirali iz celic MC38, HCT-116 in tumorskega tkiva z uporabo reagenta TRIzol v skladu z navodili proizvajalca. Reakcijski volumen je bil 20 µL in je vseboval: 1 µg RNA, 5 µL 5×Hiscript III qRT SuperMix in dH2 O brez RNaze. cDNA je bila izpostavljena kvantitativnemu PCR z reakcijskim volumnom 10 µL z 1 µL cDNA, 5 µL mešanice qPCR, 0,75 µL 5 µM primerjev (Naprej in nazaj) in 3,25 µL dH2 O brez RNaze. Primerje je sintetiziral GenScript Biotech Corporation (Nanjing, Kitajska) v skladu z naslednjimi zaporedji (spletna dodatna tabela 2).

Odkrivanje ciljev s pristopom profiliranja dostopnosti, ki se odziva na cilje

Preverjanje proteinov, ki vežejo CAG, je bilo izvedeno, kot je opisano prej.31 32 Na kratko, pristop ciljno odzivnega profiliranja dostopnosti (TRAP) je bil uporabljen za odkrivanje proteinov, ki vežejo CAG, v celičnem okolju s spremljanjem lizina, povzročenega z vključitvijo liganda. dostopnost se spremeni na ravni proteoma. Na kratko, dve posodi s celicami smo obdelali z 1 0 µM CAG oziroma dimetil sulfoksidom (DMSO). Po 1--urni inkubaciji so bile celice permeabilizirane s pufrom M-PER (Thermo Scientific) in nastali lizati so bili kovalentno označeni z dodatkom formaldehida in kompleksa boran piridina, ki skupaj specifično označujeta proteinske ostanke lizina pri sobni temperaturi za profiliranje dostopnosti . Nato smo lizate oborili z organskim topilom in zbrane pelete ponovno raztopili v 8 mol/l sečnine, reducirali z ditiotreitolom (DTT) pri 56 stopinjah 30 minut, čemur je sledila alkilacija z jodoacetamidom (IAA) v temi 30 minut. Ponovno smo dodali ustrezno količino raztopine DTT, da je reagirala s presežkom IAA. Nato smo proteom razredčili z raztopino amonijevega bikarbonata, dokler končna koncentracija sečnine ne doseže 1 mol/l. Zbrane presnovke beljakovin so bile razsoljene na C18 HLB kolonah (Waters, Milford, Massachusetts, ZDA), obogateni peptidi pa posušeni in rekonstituirani v 0,1-odstotni vodni raztopini mravljinčne kisline (FA). Sistem AnanoLCSYNAPT G2 Si Q-TOF (Waters) je bil uporabljen za analizo vzorcev za kvantitativno profiliranje sprememb dostopnosti lizina kot odgovor na vezavo CAG za odkrivanje tarče. Za zajem podatkov je bil uporabljen zajem podatkov na podlagi odvisnosti v pozitivnem načinu. Analiza podatkov je bila izvedena z uporabo PEAKS Studio V.8.5 (BSI Solutions, Waterloo, Kanada). Natančneje, cys alkilacija je bila izbrana kot fiksna modifikacija, oksidacija metionina in dimetilacija lizina, dosežena z označevanjem TRAP, pa sta bili nastavljeni kot spremenljive modifikacije. Na kratko, peptidi, ki vsebujejo dimetilacijo, povzročeno s TRAP, in so pokazali pomembne spremembe številčnosti z inkubacijo CAG in brez nje, so bili dodeljeni kot ciljno odzivni peptidi. Razmerje številčnosti vsakega peptida, označenega s TRAP, kaže na obseg spremembe dostopnosti in je tesno povezano z afiniteto za vezavo liganda. Izveden je bil Studentov t-test, da bi ocenili, ali so zaznane spremembe dostopnosti označenih peptidov statistično značilne. Medskupinska p-vrednost (str<0.001) and R-value (TRAP ratio > 2 or <0.5) were set as the cut-off to screen the target responsive peptides belonging to the CAG binding proteins from the whole quantified proteome.

Organoidna kultura

Človeške organoide raka debelega črevesa in danke je izdelal in gojil Chongqing Kingbiotech.33 Vzorce bolnikovega tkiva, pridobljene s kirurškim posegom, so s sterilnimi škarjami sesekljali na čim manjše kose. Koščke tkiva smo temeljito premešali z Matrigelom (Corning, kat. št. 356231) v približnem razmerju 1:4 na ledu. Kasnejša obdelava se je nanašala na objavljene protokole. Na kratko, suspenzije kosov-Matrigel so bile hitro posejane v ploščo z več vdolbinicami, da so nastale polkrogle kapljice in prenesene na 37 stopinj za 15–20 minut, kar je omogočilo, da so se kapljice strdile. Dodali ustrezno količino gojišča kulture (KingcultureTM Organoid Growth Medium, Cat#KCW-2) ​​v vsako vdolbinico in zamenjali gojišče vsake 2–4 dni.

Izolacija in kultura človeških CD8 T celic

Periferni krvi zdravih ljudi dodajte enako količino fiziološke raztopine, ki vsebuje antikoagulante, da razredčite celotno kri. Dodajte določen volumen raztopine za ločevanje v epruveto za centrifugo s prostornino 15 ml, počasi dodajte razredčeno polno kri vzdolž stene epruvete do vrha raztopine za ločevanje in centrifugirajte 20 minut pri 750 g. Po centrifugiranju s pipeto previdno posesajte monocite v srednji beli plasti v 15 ml centrifugalno epruveto, dodajte določeno količino PBS za resuspendiranje, centrifugirajte 250 g 5 minut in zavrzite supernatant. Po dodajanju človeških CD8 magnetnih kroglic celičnim oborinam so bile CD8 T celice razvrščene s sortirno kolono LS. Celice CD8 T smo dodali na perforirano ploščo, predhodno prevlečeno s 5 µg/mL CD3 (Thermo Fisher Scientific Cat# 16-0032-38, RRID: AB_2865578) protitelesom in nato 10 ng/mL IL{{15} } (Peprotech Cat # 212-12) in 5 µg/mL CD28 (Thermo Fisher Scientific Cat # 16-0281-81, RRID: AB_468920) funkcionalna protitelesa smo dodali gojiti 24 ur.

Kokultura

Potem ko so bili organoidi inkubirani s CAG 24 ur, je bil svež gojišče zamenjan, nato pa so bili organoidi in aktivirane celice CD8 T suspendirani v matričnem gelu, nato pa je bila suspenzija dodana na ploščo s šestimi jamicami in postavljena v 37 stopinj inkubatorju 15 minut, nato pa smo za 24 ur dodali 2 ml popolnega gojišča brez seruma.

Western blot

Celice MC38 in HCT-116 so bile 6 ur zasejane v plošče s šestimi jamicami in nato nadaljnjih 24 ur obdelane s CAG. Celice smo trikrat sprali s hladnim PBS in centrifugirali pri 180 g 5 minut pri 4 stopinjah. Celoten protein smo lizirali z lizo WB-IP, ki je vsebovala 1 odstotek inhibitorja proteaze 30 minut na ledu. Celotne beljakovine so bile ocenjene s kompletom za kvantitativno določanje beljakovin BCA. Vzorci beljakovin so bili ločeni z elektroforezo v 10- do 12-odstotnem SDS poliakrilamidnem gelu in preneseni na PVDF (poliviniliden fluorid) membrane pri 350 mA za 90 minut. PVDF membrane so bile blokirane s 5 odstotki BSA za 1 uro, trakovi z navedenim primarnim protitelesom čez noč in s sekundarnim protitelesom inkubirani 90 minut pri sobni temperaturi. Končno so bili trakovi odkriti s sistemom kemiluminiscentnega substrata LumiGLO (KPL, Gaithersburg, Maryland, ZDA).

Pretočna citometrija

Po prebavi tumorskega tkiva smo pripravili enocelično suspenzijo. Površinsko barvanje smo izvedli s površinskimi antigenskimi protitelesi v pufru FCM (pretočna citometrija) (PBS, ki vsebuje 1 odstotek FBS) in obarvali na ledu z ustreznimi protitelesi 30 minut. Za odstranjevanje odmrlih celic so uporabili reaktivna barvila (eBioscience). Intracelularno barvanje citokinov je bilo izvedeno z raztopino za fiksiranje celic BD/raztopino zunajcelične membrane, celice pa so bile fiksirane in prežete ter nato obarvane s protitelesi proti citokinom v pufru Perm/Wash (BD Biosciences).

Transficirani mutirani plazmidi CTSB

Celice HCT-116 so bile zasejane v 6-plošče z jamicami za 12 ur in nato transficirane s CTSB-WT-EGFP ali CTSB mutantnimi plazmidi (Y75A, A77V in G198A) za 36 ur.

Transfekcijska interferenca ali prekomerna ekspresija plazmida CTSB v celice MC38 ali celice HCT-116

Celice MC38 (1 × 106 / vdolbinico) so bile 6 ur inokulirane v 6-plošče z vdolbinicami, nato transficirane z interferenčno RNA CTSB (zaporedje: naprej-GGACAUAGAUCUACCUGAATT in vzvratno-UUCAGGUAGAUCUAUGUCCTT) 48 ur in nivoji izražanja mRNA ali beljakovin Ctsb in H2-k1. HCT-116 celice (1×106 /vdolbinico) so bile 6 ur inokulirane v 6-plošče z vdolbinicami, nato transficirane z interferenco CTSB (zaporedje: GCTGGTCA ACTATGTCAACAA) ali prekomerno ekspresijskim plazmidom 48 ur in mRNA ali so bile odkrite ravni ekspresije beljakovin CTSB in HLA-A.

Priklopna tehnologija

3D struktura CTSB je bila prenesena iz zbirke podatkov o beljakovinah (PDB ID: 2iPP), strukture CAG pa so bile prenesene iz PubChem. Postopek priklopa je bil izveden v programu Autodock 2 z grobim priklopom z uporabo simuliranega algoritma žarjenja in naknadno izboljšavo z uporabo genetskega algoritma.

Test celičnega toplotnega premika

Celice MC38 so bile čez noč posejane v 10cm plošče in nato še 2 uri obdelane s CAG ali 0,1-odstotnim DMSO. Celice smo zbrali, sprali s hladnim PBS in centrifugirali pri 180 g 5 minut. Celice smo nato enakomerno razdelili v centrifugirne epruvete (70 µL vsaka epruveta) in segrevali 3 minute pri naslednji temperaturi: 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64 in 67 stopinj, vzorce ohlajali 3 minute pri temperaturah in nato hranijo na ledu. Nato smo vzorce čez noč postavili v hladilnik na -80 stopinj. Vzorci so bili odmrznjeni pri sobni temperaturi 30 minut in nato ohlajeni pri -80 stopinjah 4 ure. Nazadnje smo vzorce centrifugirali pri 12, 000g 25 minut, supernatant dodali polnilnemu pufru in analizirali z Western blottingom.

Imunohistokemijsko barvanje

Parafinske dele tumorskega tkiva smo za 20 minut potopili v ksilen za razvoskanje in nato za 10 minut v 100-odstotni, 75-odstotni in 50-odstotni etanol. Potem ko so bile rezine izpostavljene popravilu antigena z raztopino za popravilo antigena natrijevega citrata, je bil endogeni vodikov peroksid inaktiviran s 3 odstotki vodikovega peroksida. Po 1-urnem blokiranju s 5-odstotnim kozjim serumom smo dodali protitelo proti Ki67 (1:200) in inkubirali čez noč pri 4 stopinjah. Dodali smo anti-mišji/kunčji HRP označen polimer (100 µL) in vzorce inkubirali pri 37 stopinjah 30 minut, čemur je sledilo 100 µL delovne raztopine DAB in inkubirali pri sobni temperaturi 5 minut. Po 1 minuti obarvanja s hematoksilinom smo vzorce 5 minut spirali v 50-odstotnem, 75-odstotnem in 100-odstotnem etanolu in ksilenu, za zapiranje filma pa smo uporabili nevtralni gumi. Film smo opazovali in fotografirali pod mikroskopom.

Statističnianalizo

Statistična analiza je bila izvedena s programsko opremo GraphPad Prism (V.8.0). Vsi rezultati so izraženi kot povprečje ± SEM treh neodvisnih poskusov. Enosmerna analiza variance, ki ji je sledil Dunnettov post hoc test, je bila uporabljena za ovrednotenje razlik, ko sta bili skupini več kot dve. Za ovrednotenje pomembne razlike med obema skupinama je bil uporabljen Studentov t-test. Statistična pomembnost je bila določena na str<0.05.

REZULTATI

Enocelična multiomična analiza CAG, ki zavira rast presajenega raka debelega črevesa pri miših

Da bi raziskali, ali ima CAG protitumorski učinek, smo najprej presadili rakave celice MC38 v miši C57BL/6. Opazili smo, da je CAG znatno zaviral rast tumorjev (spletna dodatna slika S1A, B). Nato smo celice CT26 presadili v miši BALB/c in ugotovili, da CAG zavira tudi rast tumorjev (spletna dodatna slika S1C, D).

Za nadaljnje razkrivanje specifičnega mehanizma, s katerim CAG zavira rast tumorja, smo ga analizirali s tehnikama scRNA-seq in scATAC-seq (slika 1A). Celično populacijo smo razdelili v štiri skupine: rakave celice, fibroblasti, mieloidne celice in limfociti (slika 1B, spletna dodatna slika S2A, B). Ugotovili smo, da so bile rakave celice (52 odstotkov) in fibroblasti (41 odstotkov) večinoma infiltrirane v tumorska tkiva, medtem ko so imunske celice predstavljale le 7 odstotkov. Nato smo rakave celice razdelili na osem podskupin in fibroblaste na tri podskupine (slika 1C–E). Kasneje je obogatitvena analiza visoko izraženih genov v vsaki celični populaciji pokazala, da so bile molekularne poti MHC-I v rakavih celicah obogatene, prav tako protitumorski signali T celic in NK celic (spletna dodatna slika S2C). Nato so bile najdene tudi štiri skupine celic z uporabo analize integracije scATAC-seq in scRNA-seq (slika 2D–G). Po primerjavi smo ugotovili, da so se rakave celice (celice C01, C03), celice CD8 plus T, celice Spp1 plus TAM in fibroblasti (celice F01 in F02) pojavile v sekvenciranju ATAC (slika 1F, G) in nadalje močno izražene transkripcijski faktorji so bili obogateni v teh celicah (slika 1H). S temi analizami špekuliramo, da je zaviranje rasti tumorja s CAG tesno povezano s spremembami v teh celicah.

Cag spodbuja predstavitev antigena tumorskih celic

Za analizo protitumorskega mehanizma CAG smo najprej analizirali populacijo tumorskih celic in rakave celice razdelili v osem podskupin (slika 2A, B, spletna dodatna slika S3A). Rezultati so pokazali, da so se celice skupine C05 v primerjavi s skupino PBS znatno zmanjšale, medtem ko so se celice skupine C07 povečale (slika 2C). Medtem, da bi preverili točnost našega združevanja tumorskih celic, smo primerjali CNV limfocitov in mieloidnih celic kot referenčnih celic. Rezultati so pokazali, da je bila CNV rakavih celic znatno višja kot pri imunskih celicah (spletna dodatna slika S3B). Pri analizi podskupin rakavih celic smo ugotovili, da so bili geni za odziv na interferon Isg15, Irf7, Ifit3 in Ifi47 močno izraženi v celičnih populacijah C07 in C08 skupine CAG v primerjavi s skupino PBS (spletna dodatna slika S3C). Analiza populacije tumorskih celic je pokazala, da so bile poti, povezane s predstavitvijo antigena, znatno obogatene v več celičnih populacijah. Zato špekuliramo, da lahko CAG spodbuja predstavitev antigena rakavih celic, da igra protitumorsko vlogo (slika 2D). Nato smo izbrali gene, povezane s predstavitvijo antigena, in ugotovili, da je bila raven izražanja v skupini CAG znatno višja kot v skupini PBS (slika 2E, spletna dodatna slika S3D). Ugotovili smo tudi, da CAG spodbuja predstavitev antigena v tumorskih tkivih (slika 2F, G).

Nato smo uporabili scATAC-seq za analizo specifičnih razlogov za predstavitev antigena tumorskih celic, ki spodbuja CAG. Ugotovili smo, da je populacija tumorskih celic močno izrazila transkripcijske faktorje Fos, Junb, Jund, Fosb in Fosl1 (slika 2H, I). Kasneje smo izdelali zemljevid interakcij med transkripcijskimi faktorji in ustreznimi geni, da bi pojasnili, da je CAG spodbujal izražanje genov, povezanih s predstavljanjem antigena tumorskih celic (slika 2J). V tumorskih tkivih smo ugotovili tudi, da so bili transkripcijski faktorji Junb, Fos, Jund in Fosb znatno čezmerno izraženi v skupini PBS pri zdravljenju s CAG (slika 2K–N, spletna dodatna slika S3E-I). Doslej smo ugotovili, da lahko CAG spodbuja izražanje transkripcijskih faktorjev genov, povezanih z antigenom, in s tem izboljša antigen-predstavitveno funkcijo rakavih celic. Vendar ostaja nejasno, kako se te rakave celice odzivajo na odzive imunskih celic.

Da bi odkrili pojav, s katerim CAG spodbuja predstavitev antigena rakavih celic, smo izvedli analizo poti, da bi raziskali, kako se rakave celice med seboj spreminjajo kot odgovor na odzive imunskih celic. Ugotovili smo, da so se rakave celice C07 sčasoma preoblikovale v celice C05, C06 in C08, obogatitev genov pa je tudi pokazala, da bi se rakave celice preoblikovale v predstavitev antigena (slika 3A–E).

CAG poveča funkcijo ubijanja imunskih celic

Ti rezultati kažejo, da lahko CAG predstavi antigene tumorskih celic, ali bo izboljšanje predstavitve antigena tumorskih celic vodilo do izboljšanja delovanja imunskih celic? Da bi to ugotovili, smo analizirali limfocite oziroma mieloične celice. Rezultati so pokazali, da je CAG spodbujal infiltracijo celic CD8 plus T v tumorskih tkivih, povečala pa se je tudi infiltracija celic CD8 plus T in celic NK, kar je zaznala pretočna citometrija (spletna dodatna slika S4A-F). Opazili smo tudi, da je CAG povečal izražanje genov Ifitm2, Cxcr6 in S100a6 v celicah CD8 plus T,

Geni Fcer1g, Gzmb, AW112010 in Zfp36i2 v celicah NK ter geni Nfkbia in Junb v celicah CD4 plus T (spletna dodatna slika S4G). Ekspresija Ifng in Gzmb v celicah CD8 plus T je bila prav tako znatno povečana, kot je odkrila pretočna citometrija (spletna dodatna slika S4H, I). Poleg tega smo ugotovili, da se je po zdravljenju s CAG zmanjšala ekspresija inhibitornih receptorjev Lag3, Tigit in Havcr2 na površini celic CD8 plus T ter ekspresija genov Cd28, Cd69, Gzmk, Ccl5 in Pdcd1, ki označujejo aktivacija celic CD8 plus T, znatno povečana (spletna dodatna slika S4J). Da bi dodatno preverili, da je CAG okrepil funkcijo ubijanja celic CD8 plus T s spodbujanjem povečane predstavitve tumorskega antigena, smo presadili celice CT26 v presajene tumorje pri golih miših in opazili, da CAG ne more učinkovito zavirati rasti tumorjev (spletna dodatna slika S4K-M ).

Po tem smo analizirali mieloidne celice in ugotovili, da so se celice Spp1 plus TAM povečale po zdravljenju s CAG, medtem ko se je število celic C1qc plus TAM zmanjšalo in število Il1b plus monocitov povečalo (spletna dodatna slika S5A-D). Po zdravljenju s CAG so bile celice Spp1 plus TAM in C1qc plus TAM bolj dovzetne za provnetno transformacijo TAM. Obogatitvena analiza je pokazala, da se osredotoča predvsem na Tnf-, Ifn-g in signalno pot vnetnega odziva (spletna dodatna slika S5E-H). Na podlagi zgoraj omenjenih rezultatov sklepamo, da CAG poveča funkcijo prepoznavanja in ubijanja imunskih celic s spodbujanjem predstavitve antigena v rakavih celicah. Vendar ni jasno, kako je CAG urejen.

Odkritje ciljnega proteina CAG CTSB s pastjo

Nato bomo raziskali specifično ciljno beljakovino CAG, ki ima protitumorsko vlogo. Za predmet raziskave smo izbrali rakave celice, ker smo ugotovili, da lahko CAG izboljša predstavitev antigena rakavih celic in s tem poveča ubijalsko funkcijo imunskih celic. Najprej smo sintetizirali biotinski derivat CAG in ugotovili, da lahko reagira le 3-OH (spletna dodatna slika S6A). Nato smo raziskali, ali CAG-biotin spodbuja tudi izražanje genov, povezanih s predstavitvijo antigena, v mišji tumorski celični liniji MC38. Rezultati kažejo, da CAG-biotin ni vplival na izražanje genov H2-K1, Cd74 in Anxa1 (spletna dodatna slika S6B-D).

Zato smo v laboratoriju uporabili prejšnjo metodo iskanja tarče TRAP.32 CAG in DMSO sta bila oba inkubirana s celično linijo MC38 (slika 4A). Izbrali smo protein s FC večjim ali enakim 2 in ap manjšim ali enakim 0.05 kot kandidatni ciljni protein CAG. Po načelu, da bo vezava majhnih molekul na beljakovine povzročila nizko učinkovitost označevanja lizina, smo za študijo izbrali CTSB (slika 4B). Nato smo uporabili test celičnega termičnega premika (slika 4C) in mikroskalno termoforezo (MST) (slika 4D), da preverimo vezavo med CAG in CTSB, ter ugotovili, da je bila afiniteta med CAG in CTSB 26,6 nM (slika 4D). Nato smo predvideli vezavna mesta med CAG in CTSB glede na kristalno strukturo beljakovin CTSB v knjižnici PDB. Ugotovili smo, da so hidroksilne skupine na obeh koncih CAG in mest ALA77 in GLY198 CTSB vezane z vodikovo vezjo, medtem ko so bila mesta TYR75, PRO76 in ALA173 CAG in CTSB vezana z van der Waalsovo silo (slika 4E) . Da bi preverili vezno mesto med CAG in CTSB, smo transfektirali mutirani plazmid CTSB v celice HCT-116. Rezultati kažejo, da je bila afiniteta med mutiranim plazmidom pri A77V ter G198A in CAG stokrat višja od afinitete plazmida WT (slika 4F, G). V naslednjem razdelku raziskujemo poseben mehanizem, s katerim ima CAG protitumorsko vlogo prek CTSB.

【Za več informacij:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】