Konstrukcija rekombinantnega cepiva Lactobacillus Casei proti PEDV in njegovega imunskega odziva pri miših

Povzetek

Ozadje: Prašičja epidemična driska (PED) je nalezljiva črevesna bolezen, ki jo povzroča virus prašičje epidemične driske (PEDV), za katero so značilni bruhanje, driska, anoreksija in dehidracija, ki so povzročile velike gospodarske izgube po vsem svetu. Trenutno je imunost na cepivo še vedno najučinkovitejša metoda za nadzor širjenja PED. V tej študiji smo konstruirali nov rekombinantni sev L. casei-OMP16-PEDVS, ki izraža protein PEDVS iz PEDV in protein OMP16 iz seva Brucella abortus. Da bi ugotovili imunogenost rekombinantnega cepiva L. casei-OMP16-PEDVS, so ga primerjali z BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{{ 9}} PEDVS in rekombinantni protein BL21-PEDVS.

Rezultati: Rezultati so pokazali, da lahko zaznamo višje ravni IgG, nevtralizirajočih protiteles, IL-4, IL-10 in INF- v serumu ter IgA v blatu L. casei-OMP16- PEDVS imunizirane miši, kar je pokazalo, da lahko kandidatno cepivo L. casei-OMP16-PEDVS povzroči višje ravni humoralne imunosti, celične imunosti in imunosti sluznice.

Zaključek: Zato je L. casei-OMP16-PEDVS obetavno kandidatno cepivo za profilakso okužbe s PEDV.

Ključne besede: PEDV, cepivo proti Lactobacillus casei, protein PEDV S, OMP16, imunski odzivi

koristi cistanche za moške - krepitev imunskega sistema

Uvod

Prašičjo epidemično drisko (PED) povzroča virus prašičje epidemične driske (PEDV) s simptomi, vključno z drisko, bruhanjem, anoreksijo, dehidracijo in izgubo teže pri pujskih [1, 2]. Prašiči vseh starosti so lahko okuženi z različnimi simptomi in stopnja umrljivosti pujskov je do 100 % [3], kar je povzročilo velike gospodarske izgube po vsem svetu. Za nadzor nad širjenjem PEDV je izdelana večina vrst cepiv, kot so inaktivirano cepivo z aluminijevim hidroksidom, dvovalentno neaktivno cepivo proti prenosljivemu gastroenteritisu (TGEV) in cepivo PEDV ter oslabljeno cepivo PEDV [4]. Čeprav imajo ta cepiva pomembno vlogo pri nadzoru PED, imajo vsa svoje pomanjkljivosti. Inaktivirana cepiva ne morejo aktivirati celičnega imunskega odziva, oslabljeno cepivo ni zelo varno in ne morejo inducirati zadostne proizvodnje za virus specifičnih protiteles IgA imunskega odziva sluznice. Zato je nujno in nujno razviti novo cepivo za nadzor PED.

Lactobacillus casei se pogosto obravnava kot nekakšen varen vektorski sistem za ciljno dostavo antigenov pri oralni imunizaciji, s koristnimi učinki na zdravje ljudi in živali [5]. Medtem se lahko uporablja kot dostavni sistem za uravnavanje odziva celic T-pomočnic in spodbujanje izločanja specifičnih IgA za imunost sluznice [6]. Po drugi strani pa je rekombinantno cepivo Lactobacillus casei enostavnejše za dajanje, manjša je možnost preobčutljivostne reakcije in je stroškovno učinkovitejše v primerjavi s tradicionalnimi cepivi. Na podlagi poročil se rekombinantna cepiva Lactobacillus casei uspešno uporabljajo pri preprečevanju in obvladovanju humanega papiloma virusa, Streptococcus pneumonia in Escherichia coli [7–9]. Obstaja tudi nekaj podobnih poskusov oblikovanja cepiv proti PED. Raziskovalci so ugotovili, da lahko rekombinantni sev Lactococcus lactis, ki izraža variantni gen S1 virusa prašičje epidemične diareje, inducira visoke ravni IL-4 in IFN- pri imuniziranih miših [10]. Cepivo proti PEDV na osnovi Lactobacillus casei, ki izraža peptid Co1, ki cilja na mikrozložljive celice, spojen z antigenom COE PEDV, bi prav tako lahko sprožilo učinkovit imunski odziv [11]. Za izboljšanje učinkovitosti cepiva PEDV. V tej študiji konstruiramo novo rekombinantno cepivo Lactobacillus casei proti PED, ki lahko stimulira močnejše mukozne, humoralne in celične imunske odzive proti okužbi s PEDV s peroralnim dajanjem. PEDV, član družine coronaviridae, je sestavljen iz štirih strukturnih proteinov, ki vsebujejo 150–220 kDa glikoziliran spike (S) protein, 20–30 kDa membranski (M) protein, 7 kDa ovojni (E) protein, 58 kDa nukleokapsid (N) protein [12]. Tam lahko protein S razdelimo na domeni S1 (1–735 aminokislin) in S2 (736-zadnja aminokislina) [13], protein S1 pa vključuje regijo, ki veže receptorje, in glavne nevtralizirajoče epitope [ 14]. Adjuvans cepiva deluje kot imunomodulator in lahko inducira in okrepi imunski odziv proti sočasno dostavljenim antigenom. Preverjeno je bilo, da protein OMP16 seva Brucella abortus aktivira dendritične celice in vivo, inducira imunski odziv th1 in je bil obetavno samoadjuvantno cepivo [15–17]. Zato je bil v naši študiji protein OMP16 vstavljen v rekombinantno cepivo Lacto bacillus case. Doslej so poročali o nekaj študijah o rekombinantnem cepivu Lactobacillus casei re proti PEDV. Zato je cilj te študije izdelati novo kandidatno peroralno cepivo proti Lactobacillus casei, ki lahko zagotovi boljšo humoralno imunost, celično imunost in imunost sluznice za preprečevanje širjenja PED.

Kitajska rastlina cistanche - protitumorska

Materiali in metode

Bakterijski sevi, virusi, pogoji gojenja, plazmidi in primerji

Cistanche v prahu

Bakterijski sevi, plazmidi in primerji, uporabljeni v tej študiji, so navedeni v tabeli 1. Standardni referenčni sev Lactobacillus casei ATCC 393 je bil gojen v juhi de Man Rogosa in Sharpe (MRS) pri 37 stopinjah [18]. BL21 (DE3) in DH5 sta bila gojena v mediju Luria-Bertani (LB) pri 37 stopinjah [19]. Rekombinantne seve Lactobacil lus casei, BL21 (DE3) in DH5 smo gojili v ustreznem mediju z ustreznimi antibiotiki. Brucella abortus je bila gojena v mediju Tryptic Soy Broth (TSB) ali Tryptic Soy Agar (TSA) (Difco Laboratories, Detroit, MI, ZDA) pri 37 stopinjah. Celice Vero, okužene s sevi PEDV, so gojili v DMEM (Gibco, Langley, VA, ZDA), dopolnjenem z 10 ug/ml tripsina (Gibco, Langley, VA, ZDA) [20]. Plazmida pVE5523 in pET28a (+) sta bila ekspresijska vektorja Lactobacillus casei oziroma Escherichia coli.

Tabela 1 Značilnosti bakterijskih sevov, plazmidov in primerjev, uporabljenih v tej študiji

Konstrukcija rekombinantnih sevov Lactobacillus casei in BL21

Rekombinantni ekspresijski plazmidi so bili konstruirani na podlagi plazmidov in primerjev v tabeli 1. Najprej so bili delno zaporedje gena PEDV S (493–708 aminokislin), delno zaporedje gena PEDV S' (493–708 aminokislin), in delno zaporedje gena Brucella abortus OMP16 (26–168 aminokislin) smo pomnožili z uporabo parov primerjev PEDVS-F1/R1, PEDVS-F2/R2 oziroma OMP16-F/R. Kasneje je bila metoda razširitve prekrivanja uporabljena v fragmentih OMP16 in PEDVS za konstruiranje novega fragmenta OMP16-PEDVS s povezovalnim polipeptidom (GGGGSGGGGGGGGGS), ki je obtičal na sredini. Nato smo fragmente PEDVS vstavili v plazmid pET28a z restrikcijskimi encimi EcoRI/XbaI, da smo ustvarili rekombinantni plazmid pET28a-PEDVS, nove fragmente OMP16-PEDVS pa smo vstavili v plazmida pET28a in pVE5523 z EcoRI/XbaI in SalI/EcoRV restrikcijskih encimov za ustvarjanje rekombinantnega plazmida pET28a-OMP16-PEDVS oziroma pVE5523-OMP16-PEDVS. Rekombinantne plazmide (pET28a-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS in pVE5523-OMP16-PEDVS) smo transformirali v BL21 (DE3) ali Lactobacillus casei ATCC393 s transformacijo ali elektroporacijo na osnovi prijavljeni dokument [21].

Analiza izražanja beljakovin z Western blotom

Ekspresija beljakovin sevov BL21-pET28a-PEDVS, BL21- pET28a-OMP16-PEDVS in L. casei-pVE5523-OMP16- PEDVS je bila odkrito na podlagi opisane metode z nekaj spremembami [21–23]. Rekombinantna seva BL21-pET28a-PEDVS in BL21-pET28a OMP16-PEDVS smo gojili v brozgi LB, IPTG pa smo uporabili za pobiranje v pET28a-PEDVS in pET28a-OMP{{22} } PEDVS proteini. Prazen vektor je bil uporabljen kot negativna kontrola. Po celični lizi in centrifugiranju smo zbrali supernatant in usedlino. Nato smo ciljne proteine ​​očistili z uporabo kolone za afinitetno kromatografijo za nikelj na podlagi prejšnje študije [24]. Medtem smo kulturni supernatant rekombinantnega seva L. casei pVE5523-OMP16-PEDVS prav tako pobrali s centrifugiranjem pri 9000 × g 10 minut pri 4 stopinjah. Nato so bili vzorci s pufrom za nalaganje natrijevega dodecil sulfata (SDS) kuhani 10 minut. Proteine ​​smo ločili z elektroforezo v 12% natrijevem dodecil sulfatu in poliakrilamidnem gelu (SDS-PAGE) in nato prenesli v PVDF membrane (Millipore, Mississauga, ON, Kanada). Membrane so bile blokirane s 5 % posnetim mlekom za 2 uri pri 37 stopinjah in nato inkubirane z mišjim monoklonskim protitelesom proteina S čez noč pri 4 stopinjah in HRP konjugiranim kozjim protimišjim IgG (ABclonal, Wuhan, Kitajska) 2 uri pri 37 stopinj. Proteinske pasove smo vizualizirali z uporabo Clarity™ Western ECL Blotting Substrate (Bio-Rad, Hercules, CA, ZDA).

Imunizacija in odvzem vzorcev

Imunogenost rekombinantnega cepiva Lactobacillus casei je bila ovrednotena z uporabo šest tednov starih samic miši BALB/c brez specifičnih patogenov (SPF) [10, 18], ki so bile kupljene pri centru za živali Shandong Agricultural University. Skupno 50 miši je bilo naključno razdeljenih v 5 skupin z 10 mišmi v vsaki skupini. Miši smo imunizirali z rekombinantnim cepivom Lactobacillus casei in prečiščenim proteinom (pET28a-PEDVS, pET28a OMP16-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS+Freundov popolni adjuvans). Protokol cepljenja je bil izveden na podlagi tabele 2 in obnovitvena imunizacija je bila izvedena po 13 dneh. Za serološko študijo je bil serum zbran 0, 14 in 28 dni po imunizaciji (dpi) s prebadanjem repne vene in shranjen pri –20 stopinjah do uporabe. Iztrebki so bili zbrani 1 dan pred cepljenjem in ob vsakem poživljanju. Za odkrivanje IgA smo blato razredčili (w/v) z 0,05 M natrijevo EDTA v razmerju 1:4 takoj po zbiranju in inkubirali 14 ur pri 4 stopinjah po pravilnem mešanju. Supernatant smo zbrali s centrifugiranjem 12,000×g in shranili pri –20 stopinjah do uporabe. Pri 28 dpi; tri miši iz vsake skupine so bile žrtvovane in črevo je bilo obdelano za odkrivanje IgA v skladu z avtorjem, opisanim prej [10, 18, 23].

Analiza določanja ravni protiteles

Raven IgG v serumu in IgA v blatu smo merili z metodami ELISA z nekaterimi modifikacijami [18, 23]. Metode so bile naslednje: Polistirenske mikrotitrske plošče smo čez noč pri 4 stopinjah prekrili s 100 μL 10 ug/mL proteina PEDVS, OMP16-PEDVS proteina ali 100 μL rekombinantnega seva L. casei-OMP16-PEDVS . Po blokiranju s 5 % posnetim mlekom smo zbrane vzorce serijsko razredčili v PBS, dodali v treh izvodih in inkubirali pri 37 stopinjah 1 uro. Nato smo v vsako vdolbino (1:5000) dodali kozje anti-mišje IgG ali IgA protitelo (Invi trogen, ZDA), konjugirano s HRP, in inkubirali 1 uro pri 37 stopinjah. Polistirenske mikrotitrske plošče smo med vsakim korakom oprali 5-krat. Nazadnje smo v vsako vdolbino dodali 100 μL substrata TMB (tetrametilbenzidin in H2O2) in po 10 minutah dodali 50 μL stop raztopine. Vrednosti OD pri 630 nm so bile izmerjene z uporabo večmodnega bralnika plošč (EnVision).

Testi nevtralizacije virusa

Titre nevtralizirajočih protiteles PEDV v serumih smo pregledali po metodah z nekaterimi modifikacijami [25, 26]. Na kratko, mišji serum je bil toplotno inaktiviran (56 stopinj za 30 minut) in nato serijsko dvakrat razredčen v ploščah s 96 vdolbinicami (Corning, ZDA) s trojniki vsakega vzorca. Nato smo dodali enak volumen 200 sevov TCID50/50 μL PEDV v plošče s 96 vdolbinicami in inkubirali 1 uro pri 37 stopinjah. Mešanico smo dodali v nove plošče s 96 vdolbinicami, prevlečene z monosloji celic Vero, in inkubirali 1 uro pri 37 stopinjah. Celice smo nato sprali in inkubirali v vzdrževalnem mediju pri 37 stopinjah v 5 % CO2. Po 2 dneh smo z invertnim mikroskopom opazili citopatski učinek (CPE) in koncentracijo nevtralnega kalibra definirali kot najnižjo koncentracijo protiteles v serumu.

Tabela 2 Imunski protokol miši BALB/c

Odkrivanje citokinov

Za odkrivanje izločanja citokinov so supernatante pridobili iz laboratorijskih miši (0, 14 in 28 dni). Ravni izločenega IL-4, IL-10 in IFN- so bile določene s komercialnimi kompleti ELISA (Elabscience Biotechnology Co., Ltd., Wuhan) v skladu s priporočili proizvajalca. Citokin je bil kvantificiran iz različnih standardnih krivulj, pripravljenih iz standardnih reagentov, ki jih zagotavljajo kompleti, vrednost optične gostote (OD) pa je bila zaznana pri 450 nm iz vsake plošče z uporabo večmodnega bralnika plošč (EnVision) [23, 27].

Statistična analiza

Vsi podatki so bili pridobljeni iz vsaj treh neodvisnih poskusov, rezultati pa so bili predstavljeni kot povprečje ± standardni odklon (SD). Statistična analiza je bila izvedena z uporabo dvostranskih t-testov in enosmerne analize v programu Graph Pad Prism 7.0 (GraphPad Software Inc., ZDA). Pomembna razlika je bila definirana kot ∗ p < 0.05, različne stopnje pomembne razlike pa so bile označene kot ∗∗ p < 0.01, ∗∗∗ in p < 0,001 oz.

Rezultati

Verifikacija rekombinantnih sevov Lactobacillus casei in BL21

Za preverjanje konstruiranih rekombinantnih plazmidov smo rekombinantne ekspresijske plazmide pET28a-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS in pVE5523-OMP16-PEDVS razgradili z uporabo restrikcijskih encimov NcoI/XhoI in rezultati encimske razgradnje so bili prikazani na sliki 1. Velikosti ciljnih trakov v elektroforetogramih so bile enake pričakovanim rezultatom, rezultati sekvenciranja pa so pokazali, da rekombinantni ekspresijski plazmidi niso pokazali nobene mutacije. Ti rezultati so pokazali uspešno konstrukcijo rekombinantnih plazmidov pET28a-PEDVS, pET28a OMP16-PEDVS in pVE5523-OMP16-PEDVS. Rezultati western blota so pokazali, da sta bila rekombinantna proteina pET28a-OMP16-PEDVS in pET28a-PEDVS izražena v supernatantu BL21-pET28a OMP16-PEDVS in BL21- sevov pET28a-PEDVS oz. Protein pVE5523-OMP16-PEDVS je bil preverjen tudi v kulturnem supernatantu seva L. casei-pVE5523- OMP16-PEDVS. Specifični pasovi s slike 2 so pokazali, da so bili vsi rekombinantni proteini pET28a-OMP16- PEDVS, pVE5523-OMP16-PEDVS in pET28a-PEDVS vsi uspešno pobrani (slika 2).

Slika 1 Rezultati encimske razgradnje rekombinantnih plazmidov. O: Rezultati encimske razgradnje plazmida pVE5523-OMP16-PEDVS. M: D8000 lestveni marker DNA; 1: plazmid pVE5523-OMP16-PEDVS. B: Rezultati encimske razgradnje plazmida pet28a-OMP16-PEDVS in pET28a-PEDVS. M: D8000 lestveni marker DNA; 1: plazmid pet28a-OMP16-PEDVS; 2: plazmid pET28a-PEDVS

Raven protiteles IgG v serumu miši, imuniziranih s kandidatnimi cepivi

Za ovrednotenje specifične imunogenosti generiranih kandidatov za cepivo so bile izbrane miši BALB/c in razdeljene v 5 skupin. Nato so bile s komercialnimi kompleti ELISA izmerjene ravni IgG v serumu in IgA v blatu. Rezultati so pokazali, da ni bilo bistvenih razlik v ravneh IgG med cepljenimi skupinami in da pri vseh miših pred imunizacijo niso našli skoraj nobenega protitelesa IgG. Vendar so bile pozneje po prvem cepljenju ugotovljene bistvene razlike in ravni protiteles IgG v serumu po 28 dneh so bile višje kot po 14 dneh. Med 5 skupinami miši so miši, imunizirane z L. casei-OMP16- PEDVS in BL21-OMP16-PEDVS-F, pokazale podobno in najvišjo imunogenost. Zato lahko L. casei-OMP16- PEDVS in BL21-OMP16-PEDVS-F povzročita najvišjo imunogenost, sledita pa ji BL21-OMP16- PEDVS in BL21-PEDVS (slika 3).

koristi dodatka cistanche-povečanje imunosti

Kliknite tukaj za ogled izdelkov Cistanche Enhance Imunity

【Vprašajte za več】 E-pošta:cindy.xue@wecistanche.com/Whats App: 0086 18599088692/Wechat: 18599088692

Raven protiteles IgA v blatu miši, imuniziranih s kandidatnimi cepivi

Za ovrednotenje specifične imunogenosti generiranih kandidatov za cepivo so bile ovrednotene tudi ravni protiteles IgA v blatu miši. Rezultati so pokazali, da pred imunizacijo ni obstajalo nobeno posebno protitelo proti PEDVS IgA. Vendar pa so velike količine protiteles IgA v blatu L. casei-OMP16-PEDVS imuniziranih miši BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{{7} }PEDVS in BL21-PEDVS skupini miši 14 dni po imunizaciji. 28 dni po imunizaciji so ravni protiteles IgA pri miših, imuniziranih z L. casei-OMP16-PEDVS, dosegle svoj najvišji maksimum. Medtem pa ravni protiteles IgA v drugih treh skupinah niso predstavljale očitnega povečanja. Zato bi kandidatno cepivo L. casei OMP16-PEDVS lahko spodbudilo višje ravni protiteles pri imuniziranih miših v primerjavi z BL21- OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{ {18}}PEDVS in BL21- PEDVS imunizirane miši (slika 4).

Slika 2 Verifikacija rekombinantnih ekspresijskih proteinov. M: beljakovinski marker; 1: sekretorni protein tvori rekombinantni sev L. casei pVE5523-OMP16-PEDVS; 2: prečiščen protein iz seva BL21- pET28a-OMP16-PEDVS; 3: prečiščen protein iz seva BL21-pET28a-PEDVS

Raven nevtralizirajočih protiteles v serumu pri imuniziranih miših

Za oceno zaščitnega učinka kandidatnih cepiv L. casei-OMP16-PEDVS, BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP16-PEDVS in BL21-PEDVS pri miših so bile izmerjene ravni nevtralizirajočih protiteles. Rezultati so pokazali, da pred imunizacijo niso odkrili nevtralizirajočih protiteles. Nevtralizirajoča protitelesa so bila odkrita 14 dni po imunizaciji in so se povečala 14 dni po obnovitveni imunizaciji. Odziv protiteles pri miših, ki so prejele L. casei-OMP16-PEDVS, je imel močnejšo nevtralizacijsko aktivnost proti PEDV kot tisti pri miših, ki so jim peroralno dajali BL21-OMP16-PEDVS-F, BL 21-OMP16-PEDVS in BL21-PEDVS. Zato bi kandidatno cepivo L. casei OMP16-PEDVS lahko spodbudilo najvišjo raven nevtralizirajočih protiteles, ki mu sledita BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP{{ 24}}PEDVS in BL21-PEDVS (slika 5).

Ravni citokinov

Za primerjavo ravni celičnega imunskega odziva L. casei-OMP16-PEDVS, BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP16-PEDVS, in BL21-PEDVS imuniziranih miši, IL- 4, IL-10 oziroma IFN- so bili določeni. Rezultati so pokazali, da so bile vse ravni citokinov IL-4, IL-10 in IFN- v serumih miši zelo nizke in pred imunizacijo niso imele pomembne razlike. Medtem ko so podobne spremembe opazili pri rezultatih IL-4, IL-10 in IFN-. 14 dni po imunizaciji je bila raven IL-4, IL-10 in IFN- pri miših, imuniziranih z L. casei-OMP16-PEDVS, višja od BL21- OMP16-PEDVS F, BL21-OMP16-PEDVS in BL21-PEDVS imunizirane miši. 14 dni po obnovitveni imunizaciji so odkrili višjo raven IL-4, IL-10 in IFN- pri miših, imuniziranih z L. casei-OMP16- PEDVS, v primerjavi z drugimi tri skupine. Zato bi kandidatno cepivo L. casei-OMP16-PEDVS lahko spodbudilo najvišje ravni IL-4, IL-10 in IFN-, ki mu sledi BL21-OMP{{ 40}} PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDVS in BL21-PEDVS (slika 6).

Slika 3 Raven protiteles IgG kandidatnih cepiv v serumu imuniziranih miši. Serum je bil zbran na dneve 0, 14 in 28 dni pred ali po imunizaciji, pregledan s komercialnimi kompleti ELISA in izmerjen pri absorbanci 450 nm. Vrstice predstavljajo povprečje ± standardni odklon treh neodvisnih poskusov. * p < 0.05, ** p < 0,01 in **** p < 0,0001 predstavljajo naraščajoče stopnje pomembnih razlik, ns pa pomeni, da ni pomembne razlike

Diskusija

Obsežen izbruh PED, ki so ga povzročile različice PEDV, se je zgodil oktobra 2010, kar je povzročilo ogromne gospodarske izgube na Kitajskem in po vsem svetu [1]. Vendar so vsa tradicionalna cepiva zasnovana na osnovi klasičnega seva CV777, ki ne more zagotoviti zadostne zaščite za različico PEDV [4]. Za nadzor širjenja PEDV in zmanjšanje gospodarskih izgub so zasnovana tudi nova cepiva variantnih sevov PEDV. Kitajska vlada je trenutno odobrila inaktivirano cepivo PEDV in oslabljeno cepivo variantnih sevov PEDV in vsi kažejo obetavne možnosti za nadzor nad PED. Toda pri obeh vrstah novih cepiv obstajajo tudi napake. PEDV okuži prašiče skozi prebavni trakt in ima tropizem črevesnega tkiva. Zato je mukozna imunost učinkovitejša od sistemske imunosti pri preprečevanju vstopa PEDV v črevesne epitelne celice, cepiva pa morajo zagotavljati učinkovito zaščito sluznice v črevesnem traktu. Tako smo v tej študiji izdelali novo vrsto cepiva, ki lahko stimulira močnejša protitelesa IgG in IgA, specifična za PEDV. Lactobacillus casei ima potencialne imunomodulatorne lastnosti kot prenašalec cepiva in izražanje bioaktivnih spojin na celični steni te bakterije lahko spodbudi ustrezne imunske odzive [28, 29]. Široko se uporablja za izražanje več heterolognih antigenov humanega papiloma virusa, Streptococcus pneumonia in Escherichia coli kot cepiva na živalskih modelih, ki so vsi pokazali odlično imunogenost [7–9]. V primerjavi z inaktiviranim in oslabljenim cepivom lahko vektorsko cepivo Lactobacillus casei spodbudi tudi višje ravni IgA in celični imunski odziv. Študije so pokazale, da bi bila prva obrambna linija IgA v črevesju boljša od IgG pri zaščiti pujskov pred okužbo s PEDV [10, 30]. Zato se obeta razvoj nekakšnega vektorskega cepiva proti PED proti Lactobacillus casei. Na podlagi poročil lahko protein S PEDV razdelimo na domeni S1 (1–735 aminokislin) in S2 (736-zadnja aminokislina) [13], protein S1 pa vključuje receptorsko vezavno regijo in glavni nevtralizirajoči epitopi [14]. Jedrni nevtralizirajoči epitop (COE) lahko inducira močna nevtralizirajoča protitelesa proti PEDV [31, 32]. V kombinaciji z analizo antigenosti je bilo izbrano delno zaporedje gena S1 (1477–2124 bp) za konstrukcijo rekombinantnega plazmida. Dokazano je bilo, da ima izbrani majhen fragment ne samo dobro imunsko genskost, ampak tudi prispeva k izločeni ekspresiji Lactobacillus casei. Po drugi strani pa je Pasquevich ugotovil, da lahko protein 16 zunanje membrane Brucella abortus aktivira dendritične celice in vivo, inducira imunski odziv th1 in je obetavno samoadjuvantno cepivo proti sistemski in oralno pridobljeni brucelozi [15]. Podobne raziskave, ki kažejo na nelipidiran protein zunanje membrane omp16 iz Brucella spp. Dokazano je tudi, da lahko nosni adjuvans inducira th1 imunski odziv in modulira th2 alergijski odziv na beljakovine kravjega mleka [16]. Zato je bilo izbrano delno zaporedje gena omp16 za konstruiranje rekombinantnega plazmida za izboljšanje imunske funkcije v naši študiji. Da bi ugotovili, ali lahko novo priporočeno cepivo proti Lactobacillus casei povzroči humoralne imunske odzive, so izmerili ravni IgG, IgA in nevtralizirajočih protiteles. Raven protiteles IgG pri miših, imuniziranih z rekombinantnim cepivom L. casei-OMP16- PEDVS, se ni bistveno razlikovala od miši, imuniziranih z rekombinantnim cepivom BL21-OMP16-PEDVS-F re. Vendar so bile ravni IgA in nevtralizirajočih protiteles višje kot pri BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDV S in BL{{47 }}PEDVS rekombinantne miši, imitirane s cepivom. Rezultati so pokazali, da L. casei-OMP16-PEDVS lahko povzroči močnejše humoralne imunske odzive, zlasti ravni protiteles IgA. Študije so pokazale, da je IgA prva obrambna linija v črevesju in bi bil boljši od IgG pri zaščiti pujskov pred okužbo s PEDV [30]. Raziskava je tudi potrdila rezultat, da lahko rekombinantno cepivo L. casei-OMP16-PEDVS zagotovi boljšo imunološko zaščito PEDV. Da bi raziskali vrsto imunskega odziva, ki ga povzroči rekombinantni L. casei-OMP16-PEDVS, so bile odkrite ravni IL-4, IL-10 in IFN-, da bi ocenili aktivnost T limfociti. Na podlagi poročila igra IFN- pomembno vlogo pri celičnem imunskem odzivu, ki nastane, ko patogeni vdrejo v telo, IL-4 igra pomembno vlogo pri humoralnem imunskem odzivu in spodbujanju imunske tolerance in imunosti sluznice [33], IL -10 ima bistveno vlogo pri boju proti mikrobnim okužbam sluznice in ohranjanju celovitosti sluznice v črevesju [34]. Medtem so rezultati detekcije citokinov pokazali, da lahko miši, imunizirane z rekombinantnim cepivom L. casei-OMP16-PEDVS, povzročijo močnejšo ekspresijo IL-4, IL-10 in IFN-, kar podprl rezultate, da lahko rekombinantno cepivo L. casei-OMP16-PEDVS povzroči močnejši humoralni imunski odziv, raven protiteles IgA oziroma celični imunski odziv.

Slika 5 Raven nevtralizirajočih protiteles kandidatnih cepiv v serumu imuniziranih miši. Serum je bil zbran na dneve 0, 14 in 28 dni pred ali po imunizaciji in pregledan z nevtralizacijskim testom. Vrstice predstavljajo povprečje ± standardni odklon treh neodvisnih poskusov. * p < 0.05, ** p < 0.01 in **** p < 0,0001 predstavljajo naraščajoče stopnje pomembnih razlik, ns pa pomeni, da ni pomembnih Razlika

Slika 6 Odkrivanje ravni citokinov iz seruma imuniziranih miši. Serum je bil zbran na dneve 0, 14 in 28 dni pred ali po imunizaciji in pregledan s komercialnimi kompleti ELISA. Vrednost absorbance je bila izmerjena pri absorbanci 450 nm za IL-4 (a), IL-10 (b) oziroma IFN- (c). Vrstice predstavljajo povprečje ± standardni odklon treh neodvisnih poskusov. * p < {{10}},05, ** p < 0,01 in **** p < 0,0001 predstavljajo naraščajoče stopnje pomembnih razlik

Zaključek

Če povzamemo, L. casei-OMP16-PEDVS, BL21-OMP16- PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDVS in BL{{7 }}Cepiva kandidatov za PEDVS so bila izdelana v tej študiji. Medtem so ovrednotili humoralni imunski odziv in ravni celičnega imunskega odziva teh kandidatnih cepiv pri miših. Rezultati so pokazali, da lahko miši, imunizirane z L. casei-OMP16-PEDVS, proizvedejo višje ravni IgG, IgA, nevtralizirajočih protiteles, IL-4, IL- 10 in INF- v primerjavi z miši, imunizirane z BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDVS in BL21-PEDVS. Zato lahko rekombinantno cepivo L. casei OMP16-PEDVS postavi osnovo za razvoj varnega, učinkovitega in priročnega rekombinantnega mukoznega cepiva za profilakso okužbe s PEDV.

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

Reference

1. Wang D, Fang L, S X. Epidemična driska prašičev na Kitajskem. Virus Res. 2016; 226: 7–13.

2. Sueyoshi M, Tsuda T, Yamazaki K, Yoshida K, Nakazawa M, Sato K, et al. Imunohistokemična preiskava prašičje epidemične driske. J Comp Pathol. 1995;113(1):59–67.

3. Sun RQ, Cai RJ, Chen YQ, Liang PS, Song CXJEID. Izbruh prašičje epidemične driske pri sesnih pujskih, Kitajska. Emerg Infect Dis. 2012; 18 (1): 161–3.

4. Tong YE, Feng L, Li W. Razvoj dvokombiniranega oslabljenega cepiva proti transmisivnemu virusu gastroenteritisa in virusu prašičje epidemične driske. Chin J Prev Vet Med. 1999; 21 (6): 35–9.

5. Pouwels PH, Leer RJ, Boersma WJ. Potencial Lactobacillusa kot nosilca za oralno imunizacijo: razvoj in predhodna karakterizacija vektorskih sistemov za ciljno dostavo antigenov. J Biotechnol. 1996;44(1–3):183.

6. Tsai YT, Cheng PC, Pan TM. Biotehnologija: Imunomodulatorni učinki mlečnokislinskih bakterij za izboljšanje imunskih funkcij in koristi. Appl Microbiol Biotechnol. 2012; 96 (4): 853–62.

7. Adachi K, Kawana K, Yokoyama T, Fujii T, Tomio A, Miura S, et al. Peroralna imunizacija s cepivom Lactobacillus casei, ki izraža humani papiloma virus (HPV) tipa 16 E7, je učinkovita strategija za induciranje mukoznih citotoksičnih limfocitov proti HPV16 E7. Cepivo. 2010; 28 (16): 2810–7.

8. Campos IB, Darrieux M, Ferreira DM, Miyaji EN, Silva DA, Arêas APM, et al. Nazalna imunizacija miši z Lactobacillus casei, ki izraža pnevmokokni površinski protein A: indukcija protiteles, odlaganje komplementa in delna zaščita pred izzivom Streptococcus pneumoniae. Mikrobi okužijo. 2008; 10 (5): 481–8.

9. Wen LJ, Hou XL, Wang GH, Yu LY, Wei XM, Liu JK, et al. Imunizacija z rekombinantnimi sevi Lactobacillus casei, ki proizvajajo K99 in fimbrijski protein K88, ščiti miši pred enterotoksigeno Escherichia coli. Cepivo. 2012; 30 (22): 3339–49.

10. Guo M, Yi S, Guo Y, Zhang S, Niu J, Wang K, et al. Konstrukcija rekombinantnega seva lactococcus lactis, ki izraža variantni gen S1 virusa prašičje epidemične diareje, in njegova analiza imunogenosti pri miših. Virusni imunol. 2019; 32 (3): 144–50.

11. Wang X, Wang L, Zheng D. Oralna imunizacija s cepivom proti virusu prašičje epidemične diareje (PEDV) na osnovi Lactobacillus casei, ki izraža mikrofoldni celični tarčni peptid Co1, spojen z antigenom COE PEDV. J Appl Microbiol. 2017; 124 (2): 368–78.

12. Duarte M, Tobler K, Bridgen A, Rasschaert D, Ackermann M, H L. Sekvenčna analiza genoma virusa prašičje epidemične driske med nukleokapsidnimi in spike proteinskimi geni razkrije polimorfno ORF. Virologija. 1994;198(2):466.

13. Lee DK, Park CK, Kim SH, Lee C. Heterogenost v genih spike proteinov virusov prašičje epidemične diareje, izoliranih v Koreji. Virus Res. 2010; 149 (2): 175–82.

14. Sun DB, Feng L, Shi HY, Chen JF, Liu SW, Chen HY, et al. Proteinska regija (aa 636789) virusa prašičje epidemične driske je bistvena za indukcijo nevtralizirajočih protiteles. Acta Virol. 2007; 51 (3): 149–56.

15. Pasquevich KA, Garcia Samartino C, Coria LM, Estein SM, Zwerdling A, Ibanez AE, et al. Proteinski del proteina 16 zunanje membrane Brucella abortus je nov molekularni vzorec, povezan z bakterijskim patogenom, ki aktivira dendritične celice in vivo, inducira Th1 imunski odziv in je obetavno samoadjuvantno cepivo proti sistemski in oralno pridobljeni brucelozi. J Immunol. 2010; 184 (9): 5200.

16. Ibanez AE, Smaldini P, Coria LM, Delpino MV, Pacífico LGG, Oliveira SC, et al. Nelikvidirani protein zunanje membrane Omp16 (U-Omp16) iz Brucella spp. kot nosni adjuvans inducira Th1 imunski odziv in modulira Th2 alergijski odziv na beljakovine kravjega mleka. PLoS One. 2013;8(7):e69438.

17. Pasquevich KA, Estein SM, Samartino CG, Zwerdling A, Coria LM, Barrionuevo P, et al. Imunizacija: Imunizacija z rekombinantnim proteinom zunanje membrane vrste Brucella Omp16 ali Omp19 v adjuvansu inducira specifične celice CD4+ in CD8+ T ter sistemsko in oralno zaščito pred okužbo z Brucella abortus. Infect Immun. 2009; 77 (1): 436–45.

18. Ma S, Wang L, Huang X, Wang X, Chen S, Shi W, et al. Peroralno rekombinantno cepivo proti bakteriji Lactobacillus, ki cilja na celice črevesnih mikrogub in dendritične celice za dostavo jedrnega nevtralizirajočega epitopa virusa prašičje epidemije driske. Tovarne mikrobnih celic. 2018; 17 (1): 20.

19. Chu S, Zhang D, Wang D, Zhi Y, Zhou P. Heterologna ekspresija in biokemična karakterizacija asimilacijske nitratne in nitritne reduktaze razkrivata prilagoditev in potencial Bacillus megaterium NCT-2 v tleh s sekundarnim zasoljevanjem. Int J Biol Macromol. 2017;101:1019.

20. Guo N, Zhang B, Hu H, Ye S, Chen F, Li Z, et al. Caerin1.1 zavira rast virusa prašičje epidemične driske in vitro z neposredno vezavo na virus. Virusi. 2018; 10: 9.

21. Chen Z, Lin J, Ma C, Zhao S, She Q, Liang Y. Biotehnologija: karakterizacija pMC11, plazmida z dvojnim izvorom replikacije, izoliranega iz Lactobacillus casei MCJ, in konstrukcija shuttle vektorjev z vsakim replikonom. Appl Microbiol Biotechnol. 2014;98(13):5977.

22. Xiaona W, Li W, Xuewei H, Sunting M, Meiling Y, Wen S, et al. Oralno dajanje probiotikov, ki izražajo peptid, usmerjen v dendritične celice, spojen z antigenom COE virusa prašičje epidemije driske: obetavna strategija cepiva proti PEDV. Virusi. 2017;9(11):312.

23. Bhuyan AA, Memon AM, Bhuiyan AA, Zhonghua L, Zhang B, Ye S, et al. Konstrukcija rekombinantnega Lactobacillus casei, ki izraža protein BVDV E2, in njegov imunski odziv pri miših. J Biotechnol. 2018; 270: 51–60.

24. Noi NV, Chung YCJB, Oprema B. Optimizacija ekspresije in čiščenja rekombinantne domene S1 virusa virusa prašičje epidemične diareje (PEDV-S1) v Escherichia coli. Biotechnol Biotechnol Equip. 2017;31(2):1–11.

25. Li C, Li W, Esesarte E, Guo H, Elzen P, Aarts E, et al. Celične pritrdilne domene koničastega proteina virusa prašičje epidemije driske so ključne tarče nevtralizirajočih protiteles. J Virol. 2017;91(12):1–16.

26. Wen Z, Xu Z, Zhou Q, Li W, Wu Y, Du Y, et al. Peroralno dajanje obloženih mikrosfer, polnjenih s PEDV, je pri odstavljenih pujskih izzvalo za PEDV specifično imunost. Cepivo. 2019;09(014):161–6.

27. Gao Q, Zhao S, Qin T, Yin Y, Yang Q. Učinki virusa prašičje epidemične driske na dendritične celice, pridobljene iz prašičjih monocitov, in črevesne dendritične celice. Vet Microbiol. 2016; 106: 149–58.

28. Bonet MEB, Chaves AS, Mesón O. Imunomodulatorna in protivnetna aktivnost, povzročena z oralnim dajanjem probiotičnega seva lactobacillus casei. Vnetje. 2006;4(1):31–41.

29. Grangette C, Müller-Alouf H, Geoffroy MC, Goudercourt D, Turner M, Mercenier A. Zaščita pred tetanusnim toksinom po intragastričnem dajanju dveh rekombinantnih mlečnokislinskih bakterij: vpliv na sposobnost preživetja seva in obstojnost in vivo. Cepivo. 2002; 20 (27–28): 3304–9.

30. Song DS, Oh JS, Kang BK, Yang JS, Moon HJ, Yoo HS, et al. Peroralna učinkovitost seva DR13 virusa prašičje epidemične driske, oslabljenega s celicami Vero. Res Vet Sci. 2007; 82 (1): 134–40.

31. Makadiya N, Brownlie R, Jan V, Berube N, Allan B, Gerdts V, et al. Domena S1 koničnega proteina virusa prašičje epidemije driske kot antigen cepiva. Virol J. 2016; 13: 1.

32. Chang SH, Bae JL, Kang TJ, Ju K, Chung GH, Lim CW, et al. Celice: Identifikacija epitopske regije, ki lahko inducira nevtralizirajoča protitelesa proti virusu prašičje epidemične driske. Celica Mol. 2002; 14 (2): 295–9.

33. Sumi T, Fukushima A, Fukuda K, Kumagai N, Nishida T, Yagita H, et al. Različni prispevki B7–1 in B7–2 k razvoju mišjega eksperimentalnega alergijskega konjunktivitisa. Immunol Lett. 2007; 108 (1): 62–7.

34. Xue M, Zhao J, Ying L, Fu F, Li L, Ma Y, et al. IL-22 zavira okužbo črevesnih koronavirusov in rotavirusov prašičev z aktiviranjem signalne poti STAT3. Antivir Res. 2017; 142: 68–75.