Trenutno stanje nevroprotekcije pri prirojenih srčnih napakah, 3. del

3.2. Semi-kvantitativna ocena ektopične mitohondrijske DNA

Slike barvanja s Hsp60 (mitohondrijski matriks) in barvanja s histonom H2B (jedrski marker) so bile odštete od slik barvanja z dsDNA. Nato so bile slike s funkcijo "AdjustThreshold" programske opreme lmage] (National Institutes of Health) binarizirane.

Mitohondriji so tovarne energije v celicah, odgovorne za sintezo ATP za zagotavljanje energije, ki jo potrebujejo celice. Mitohondrijski matriks je notranja tekočina mitohondrijev, ki vsebuje vrsto encimov in ionov ter je ključno mesto za različne biokemične reakcije mitohondrijev. Spomin je ena najpomembnejših kognitivnih sposobnosti človeka. Čeprav se zdi, da nista povezana, sta tesno povezana.

Raziskave kažejo na interakcijo med mitohondrijskim matriksom in spominom. Encimi in ioni v mitohondrijskem matriksu lahko neposredno vplivajo na razdražljivost nevronov z uravnavanjem energetske presnove in statusa ionskih kanalov v nevronskih celicah, s čimer vplivajo na spomin. Poleg tega obstajajo različne signalne molekule v mitohondrijskem matriksu, ki se lahko prenašajo na spodnje nevrone skozi aksone in sinapse nevronov, kar vpliva na učinkovitost transdukcije signala nevronov, s čimer vpliva na nastanek in utrjevanje spomina.

Hkrati spominska aktivnost neposredno vpliva tudi na stanje mitohondrijskega matriksa. Spominske dejavnosti bodo povečale porabo energije nevronov in spodbudile redoks reakcijo v mitohondrijskem matriksu, s čimer bodo vplivale na presnovno raven mitohondrijev in znotrajcelično ionsko ravnovesje, kar bo dodatno vplivalo na razdražljivost in učinkovitost prenosa signala nevronov.

Zato je vzdrževanje dobrega zdravja mitohondrijev ključnega pomena za ohranjanje dobre funkcije spomina. Z ohranjanjem dobrih življenjskih navad, kot so redna prehrana, zmerna telesna vadba, zadosten spanec itd., lahko pomagate ohranjati zdravje mitohondrijske matrice. Poleg tega se lahko spominska funkcija izboljša tudi z ustreznim farmacevtskim posegom za spodbujanje biokemičnih reakcij in signaliziranja znotraj mitohondrijskega matriksa.

V vsakdanjem življenju lahko spomin vadimo na več načinov, kot so branje, učenje, razmišljanje, igre itd. Hkrati moramo biti pozorni tudi na ohranjanje dobrega zdravja, da bi bolje ohranili zdravje mitohondrijskega matriksa. Verjamem, da bomo s tem trudom zagotovo imeli boljši spomin in se bomo lažje spopadali z različnimi izzivi v življenju in delu. Vidi se, da moramo izboljšati spomin in Cistanche deserticola lahko bistveno izboljša spomin, saj lahko Cistanche deserticola uravnava tudi ravnovesje nevrotransmiterjev, kot je povečanje ravni acetilholina in rastnih faktorjev. Te snovi so zelo pomembne za spomin in učenje. Poleg tega lahko Cistanche deserticola izboljša pretok krvi in ​​spodbuja dostavo kisika, kar lahko zagotovi, da možgani prejmejo dovolj hranil in energije, s čimer se izboljša vitalnost in vzdržljivost možganov.

Kliknite poznajte dodatke za povečanje spomina

Izbrali smo pike dsDNA v velikosti od 2 do 20 um' (okrožnost 0.1-1.0) s funkcijo »Analiziraj – analiziraj delce«. če je bilo potrebno, so bile originalne slike pregledane za končno štetje. Če bi bil signal histona H2B majhen. potem so odštete slike pokazale krofom podobne strukture.

Te predstavljajo citosolno dsDNA jedrnega izvora in jih je treba izločiti iz količine citosolne dsDNA mitohondrijskega izvora. Razpon velikosti je mogoče spremeniti glede na tip celice ali izvor histoloških vzorcev. Slika lE prikazuje primer štetja ektopične mitohondrijske DNK

pike z uporabo 1B D.

Alternativno so bile slike obarvanja s Hsp60 odštete od slik obarvanja z dsDNA. Nato je bilo število točk dsDNA prešteto s funkcijami "Adjust-Threshold "Analyze-Analyze Particles". Nato so bile točke dsDNA brez signala histona H2B preštete z neposrednim opazovanjem. Slednja metoda je primerna, ko so slike histona H2B kažejo nizko razmerje med signalom in šumom.

Skupaj lahko ta metoda jasno prikaže ektopično mitohondrijsko DNA, ki uhaja v citoplazmo, in omogoča objektivno in statistično oceno takšne ektopične mitohondrijske DNA v celicah.

4. Razprava

V naši raziskavi smo razvili metodo, ki omogoča štetje citoplazmatske mitohondrijske DNA. Poročali so o odkrivanju citoplazemske mitohondrijske DNA z uporabo imunofluorescenčnih tehnik, vendar metode v večini primerov niso bile kvantitativne za oceno citoplazemske mitohondrijske DNA [15,25]. V drugi študiji je bila izvedena kapljična PCR za kvantificiranje krožeče mitohondrijske DNK [9].

pred kratkim sta Sato et al. [26,27] objavil odličen protokol za oceno citoplazemske DNA z imunofluorescenčno mikroskopijo z uporabo protiteles Lamin B1 (LMNB1) kot označevalca jedrske strukture in podenote 4 citokrom c-oksidaze (COX4) kot označevalca mitohondrijske strukture. Ta protokol se zdi zelo uporaben za kvantificiranje citoplazemske dsDNA jedrskega izvora.

Ko pa smo poskusili s COX4 ali drugimi markerji mitohondrijske membrane, vključno z notranjimi in zunanjimi markerji, je bilo zelo težko natančno razlikovati citoplazmo od mitohondrijev.

Na primer, če smo opazovali krožne signale z uporabo markerja mitohondrijske membrane in opazili signale dsDNA znotraj, potem bi ta dsDNA lahko predstavljala mitohondrijsko DNA znotraj krožnih mitohondrijev (normalno) ali citoplazmatsko mitohondrijsko DNA zunaj mitohondrijev, podobnih krofu (ektopična). Tako smo uporabili Hsp60 kot marker, ki označuje njihovitohondrijski matriks za oceno ektopične mitohondrijske DNA v citoplazmi.

Kot je opisano v nedavnem pregledu [23], obstaja veliko različnih vrst citoplazmatske DNK jedrskega izvora in večina jih je pozitivnih na histonske markerje. Zaradi omejitve kombinacije protiteles, ki se uporabljajo za trojno barvanje, smo uporabili histon H2Bas kot histonski marker.

Če pa se ta omejitev odpravi, je lahko H2AX boljši marker za citoplazmatsko dsDNA jedrskega izvora. Histon-H2B-negativna citoplazemska dsDNA je bila redko opažena v kontrolnih celicah HeLa, uporabljenih v tej študiji, vendar je takšna dsDNA jedrskega izvora lahko prisotna, če se uporabljajo druge celične linije ali pogoji.

Hibridizacija mitohondrijske DNA in situ, uporabljena v našem nedavnem dokumentu, je primerna za kvalitativno vrednotenje, vendar bo morda težko uporabiti hibridizacijo in situ za kvantitativno vrednotenje [8].

Hibridizacija in situ izpostavi vzorec visokim temperaturam, kar lahko povzroči deformacijo ali hrup nekaterih delov primerka. Po drugi strani pa lahko imunocitokemična metoda, predstavljena v tem prispevku, pridobi signale z nizkim hrupom v ozadju. V našem nedavnem prispevku smo v človeških celicah in ribicah cebricah, uporabljenih kot modeli Parkinsonove bolezni, pokazali, da je mitohondrijska DNK uhajala v citoplazmo, kar je strupeno za celice. Opazili smo tudi, da se je količina citosolne mitohondrijske DNA povečala v posmrtnih možganskih tkivih bolnikov s Parkinsonovo boleznijo [8].

Ti dokazi kažejo, da lahko povečana količina ektopične mitohondrijske DNK, ki izteče iz mitohondrijev, povzroči akutno in kronično vnetje, ki povzroči različne bolezni, vključno s Parkinsonovo boleznijo in srčnim popuščanjem; tako bi lahko bila uravnavanje razgradnje citosolne DNA ali zaviranje njenih senzorjev potencialna terapevtska tarča za te bolezni [8, 28].

Metoda, predstavljena v tem prispevku za kvantitativno oceno ektopične mitohondrijske DNA, služi kot pomembno orodje za nadaljnje raziskave na tem področju.

Prispevki avtorjev: HM in MTH sta oblikovala hipoteze, načrtovala večino eksperimentov, izvedla poskuse, analizirala podatke in napisala rokopis. NM je izvajal poskuse v zvezi s kultiviranimi celicami. Vsi avtorji so prebrali in se strinjali z objavljeno različico rokopisa.

Financiranje: To delo je bilo podprto z donacijami AMED (številke donacije JP21gm6110028 in JP19dm0107154 (HM)), Takeda Science Foundation (HM), JSPS KAKENHI (številke donacije JP14516799 (HM), JP 16690735 (HM) in JP 17925674 (HM) ), JST (Moonshot R&D; številka dotacije JPMJMS2024 (HM)) in Grants-in-Aid iz TBRF (številka dotacije TBRF-RF 21-135 (HM)).

Izjava o razpoložljivosti podatkov: podatki in orodja, opisani v tem rokopisu, so na voljo na zahtevo.

Zahvala: Shinano Kobayashi se zahvaljujemo za sodelovanje v koristnih razpravah in zagotavljanje stalne podpore. Zahvaljujemo se Tokyo Biochemical Research Foundation (TBRF) za zagotavljanje podoktorske štipendije TBRF za tuje raziskovalce MH (TBRF-RF 21-135).

Nasprotje interesov: Avtorji izjavljajo, da ni navzkrižja interesov.

Reference

1. Li, XD; Wu, J.; Gao, D.; Wang, H.; Sonce, L.; Chen, ZJ Ključne vloge signalizacije cGAS-cGAMP pri protivirusni obrambi in imunskih adjuvantnih učinkih. Znanost 2013, 341, 1390–1394. [CrossRef] [PubMed]

2. Ansari, MA; Dutta, S.; Veettil, MV; Dutta, D.; Iqbal, J.; Kumar, B.; Roy, A.; Chikoti, L.; Singh, VV; Chandran, B. Acetilacija jedrnega IFI16, povzročena s prepoznavanjem genoma herpesvirusa, je bistvenega pomena za njegovo citoplazmatsko translokacijo, inflammasome in odzive IFN. Patog PLoS. 2015, 11, e1005019. [CrossRef] [PubMed]

3. Orzalli, MH; Broekema, NM; Diner, BA; Hancks, DC; Elde, NC; Cristea, IM; Knipe, DM cGAS-posredovana stabilizacija IFI16 spodbuja prirojeno signalizacijo med okužbo z virusom herpes simplex. Proc. Natl. Akad. Sci. ZDA 2015, 112, E1773–E1781.[CrossRef] [PubMed]

4. Woodward, JJ; Iavarone, AT; Portnoy, DA c-di-AMP, ki ga izloča intracelularna Listeria monocytogenes, aktivira interferonski odziv tipa gostitelja. Znanost 2010, 328, 1703–1705. [CrossRef] [PubMed]

5. Dou, Z.; Ghosh, K.; Vizioli, MG; Zhu, J.; Sen, P.; Wangensteen, KJ; Simithy, J.; Lan, Y.; Lin, Y.; Zhou, Z.; et al. Citoplazmatski kromatin sproži vnetje pri staranju in raku. Narava 2017, 550, 402–406. [CrossRef]

6. Takahashi, A.; Loo, T.; Okada, R.; Kamachi, F.; Watanabe, Y.; Wakita, M.; Watanabe, S.; Kawamoto, S.; Mijata, K.; Brivec, GN; et al. Znižana regulacija citoplazemskih DNAz je vpletena v kopičenje citoplazemske DNA in SASP v starajočih se celicah. Nat.Commun. 2018, 9, 1249. [CrossRef]

7. McArthur, K.; Whitehead, LW; Huddleston, JM; Li, L.; Padman, BS; Oorschot, V.; Geoghegan, ND; Chappaz, S.; Davidson, S.; Chin, HS; et al. Makropore BAK/BAX olajšajo mitohondrijsko herniacijo in izliv mtDNA med apoptozo. Znanost 2018,359, eaao6047. [CrossRef]

8. Matsui, H.; Ito, J.; Matsui, N.; Uechi, T.; Onodera, O.; Kakita, A. Citosolna dsDNA mitohondrijskega izvora inducira citotoksičnost in nevrodegeneracijo v celičnih modelih in modelih cebric Parkinsonove bolezni. Nat. Komun. 2021, 12, 3101. [CrossRef]

9. Sliter, DA; Martinez, J.; Hao, L.; Chen, X.; Sonce, N.; Tara, D.; Fischer, TD; Burman, JL; Li, Y.; Zhang, Z.; et al. Parkin in PINK1 blažita vnetje, ki ga povzroča STING. Narava 2018, 561, 258–262. [CrossRef]

10. Hou, Y.; Wei, Y.; Lautrup, S.; Yang, B.; Wang, Y.; Cordonnier, S.; Mattson, poslanec; Croteau, DL; Bohr, VA Dodatek NAD(+) zmanjša nevrovnetje in staranje celic v transgenskem mišjem modelu Alzheimerjeve bolezni prek cGAS-STING. Proc. Natl.Acad. Sci. ZDA 2021, 118, e2011226118.

For more information:1950477648nn@gmail.com