Trenutno stanje nevroprotekcije pri prirojenih srčnih napakah, 1. del

Povzetek:

Prisotnost ektopične DNA v citoplazmi povzroči vnetje in celično smrt. Obširno so poročali, da je mogoče uhajanje jedrske DNA v citoplazmo v glavnem zaznati s ciklično GMP-AMP sintazo (cGAS).

DNK je molekula, ki določa genetske informacije vsakega človeka in se nahaja v vsaki naši celici. Novejše raziskave kažejo, da lahko DNK po določenih poteh uhaja v citoplazmo in vpliva na naš spomin.

Ta pojav je pogost pri starejših odraslih in ljudeh s kognitivnimi motnjami. Ko DNK uhaja v citoplazmo, moti normalne funkcije v celici in poveča tveganje za izgubo spomina in kognitivno okvaro.

Ni pa nujno, da se zaradi tega počutimo depresivni in brezupni. Obstaja veliko načinov za izboljšanje spomina in kognitivnih sposobnosti, ki nam pomagajo ohranjati zdrave možgane.

Najprej morate vzdrževati zdrav življenjski slog. To vključuje uživanje uravnotežene prehrane, dovolj spanja, zmerno telesno vadbo in zmanjšanje stresa. Te prakse spodbujajo zdravje možganov, s čimer se izognejo uhajanju DNK in izboljšajo spomin.

Drugič, potrebno je kognitivno usposabljanje. To lahko vključuje igranje matematičnih iger, branje, učenje novih veščin itd. Te dejavnosti lahko pomagajo stimulirati možgane in spodbujajo nevrogenezo, da se prepreči uhajanje DNK.

Končno ohranite pozitiven odnos. Čustvena nestabilnost in pretiran stres lahko povzročita spremembe v možganski kemiji, ki spodbujajo uhajanje DNK. Zato se moramo naučiti pozitivno soočati z izzivi v življenju in ohraniti optimističen odnos.

Če povzamemo, čeprav lahko uhajanje DNK v citoplazmo vpliva na spomin, lahko izboljšamo zdravje možganov, se izognemo uhajanju DNK in na koncu izboljšamo svoj spomin s pravilnim načinom življenja, kognitivnim treningom in ohranjanjem pozitivne miselnosti. Spomin in kognitivne sposobnosti. Vidimo, da moramo izboljšati spomin, in Cistanche deserticola lahko bistveno izboljša spomin, saj je Cistanche deserticola tradicionalno kitajsko zdravilno sredstvo, ki ima številne edinstvene učinke, eden od njih je izboljšanje spomina. Učinkovitost Cistanche deserticola izhaja iz številnih aktivnih sestavin, ki jih vsebuje, vključno s taninsko kislino, polisaharidi, flavonoidnimi glikozidi itd. Te sestavine lahko spodbujajo zdravje možganov na različne načine.

Kliknite spoznajte 10 načinov za izboljšanje spomina

Pred kratkim smo poročali, da citoplazemska dvoverižna DNA (dsDNA), pridobljena iz mitohondrijev, ki se je izognila lizosomski razgradnji, povzroči znatno citotoksičnost v gojenih celicah in in vivo. Domneva se, da je citoplazmatska mitohondrijska DNA vpletena v različne bolezni in motnje, in objavljenih je vedno več člankov, ki to potrjujejo. Po drugi strani pa trenutna metoda za ocenjevanje mitohondrijske DNK v citoplazmi morda ni kvantitativna.

Tukaj podrobno predstavljamo metodo za oceno zunajmaterničnih celic mitohondrijske DNA. Ta metoda je uporabna tako pri osnovnih raziskavah kot tudi pri preučevanju staranja, Parkinsonove bolezni, Alzheimerjeve bolezni, srčnega popuščanja, avtoimunskih bolezni, raka in drugih stanj.

Ključne besede: ektopična DNK; mitohondrijska DNK; mitohondrijski transkripcijski faktor A (TFAM); Parkinsonova bolezen.

1. Uvod

DNK vsebuje pomembne informacije za preživetje in dedovanje, zato jo je treba zaščititi pred različnimi stresorji, vključno z oksidanti in mutageni. Evkariontske celice vsebujejo mitohondrije, ki z aerobnim dihanjem proizvajajo energijo skupaj z veliko aktivnimi kisikovimi vrstami.

Tako v evkariontski celici DNK obstaja v jedru ali mitohondrijih, zapakirana znotraj jedrske membrane oziroma mitohondrijske membrane. Vendar pa je lahko DNK prisotna v citoplazmi pod določenimi pogoji, na primer med virusnimi ali nevirusnimi okužbami [1– 4].

Tudi v nekaterih neinfekcijskih stanjih (na primer staranje ali različne s starostjo povezane motnje ali rak) lahko DNK uhaja v citoplazmo iz jedra ali mitohondrijev [5–7].

DNK v citoplazmi je lahko vnetna in strupena za celice. Obširno so poročali, da uhajanje jedrske DNA v citoplazmo povzroči vnetje, citotoksičnost in s staranjem povezan sekretorni fenotip (SASP), predvsem preko ciklične GMP-AMP sintaze (cGAS) - stimulatorja poti genov za interferon (STING) [ 5,6].

Pred kratkim smo poročali, da se je pokazalo, da citosolna dvoverižna DNA (dsDNA) mitohondrijskega izvora, ki se izogne ​​lizosomski razgradnji, inducira citotoksičnost in nevrodegeneracijo v celičnih modelih Parkinsonove bolezni [8]. Prisotnost ali povečanje takšne ektopične DNK so pogosto nakazovali z reprezentativnimi mikroskopskimi slikami in posrednimi dokazi, ne pa s povečanjem uhajanja DNK samim.

Pričakuje se, da bo vrednotenje te zunajmaternične DNK postalo vedno bolj pomembno, ne samo za osnovne raziskave, ampak tudi za raziskave staranja in drugih bolezni, kot so Parkinsonova bolezen, Alzheimerjeva bolezen, amiotrofična lateralna skleroza, srčno popuščanje, avtoimunske bolezni, diabetes, nealkoholni steatohepatitis (NASH) in raka. Poročali so, da je pot cGAS–STING ključna ne samo pri staranju, ampak tudi pri patogenezi teh bolezni [8–17].

Verjetno zaradi oksidativnih okoliščin okoli mitohondrijev in pomanjkanja učinkovitega sistema za popravilo DNK mitohondrijske DNK je mitohondrijska DNK veliko bolj dovzetna za mutacije ali poškodbe kot jedrska DNK [18,19].

Za razliko od jedrske DNK obstaja mitohondrijska DNK v več kopijah v eni celici in se po potrebi sintetizira. Zato ima lahko mitohondrijska DNK veliko večjo možnost, da med staranjem ali malignimi stanji, kot so s starostjo povezane motnje, mitohondrijska disfunkcija, uhaja v citoplazmo. , ali raki.

Odkrivanje in merjenje takšne citoplazmatske mitohondrijske DNA bi lahko bilo pomembno pri razumevanju patogeneze različnih bolezni in staranja ter bi lahko postalo biomarker in terapevtska tarča.

Razvili smo polkvantitativno metodo za oceno ektopične mitohondrijske DNA, ki uhaja v citoplazmo, in tukaj podrobno opisujemo metodo. Ta članek omogoča objektivno oceno uhajanja mitohondrijske DNA in je uporaben pri preučevanju patologij različnih bolezni.

2. Materiali in metode

2.1. Celične linije, zdravljenje s siRNA in kvantitativna analiza PCR (qPCR).

Celice HeLa so bile pridobljene iz celic raka materničnega vratu pacientke (ATCC,CCL-2). Celice HeLa smo gojili pri 37 °C pod 5 % CO2 v Dulbeccovem modificiranem EagleMediumu (DMEM) (Nacalai Tesque, Kjoto, Japonska), dopolnjenem z 10 % fetalnega govejega seruma (FBS) (Biowest, Nuaillé, Francija) in raztopino penicilin-streptomicin ( 100 enot/ml penicilina G in 100 µg/ml streptomicin sulfata, Wako, Osaka, Japonska).

En dan pred transfekcijo smo celice HeLa nasadili pri gostoti 600 celic/µL. Izražanje zanimivih genov je bilo utišano v celicah HeLa z uporabo Stealth RNAi siRNA (mitohondrijski transkripcijski faktor A, TFAM: HSS144251, glukocerebrozidaza, GBA: HSS178140, Thermo FisherScientific, Waltham, MA, ZDA) v reagentu za transfekcijo Lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher Scientific) v skladu z navodilih proizvajalca (končna koncentracija RNA 10 nM).

Tri dni po knockdownu siRNA smo celotno celično RNA izolirali z uporabo TRIzolreagenta v skladu z navodili proizvajalca (Thermo Fisher Scientific). Vzorci cDNA so bili sintetizirani iz prečiščene RNA z uporabo ProtoScript II First StrandcDNA Synthesis Kit (New England Biolabs, Ipswich, MA, ZDA) s primerji oligo (dT)20. qPCR je bil izveden z uporabo TB Green Premix Ex Taq II (Takara Bio, Kusatsu , Japonska) in analizirali v Thermal Cycler Dice Real Time System Lite (Takara Bio). Primerji PCR, uporabljeni v tej študiji, so bili GBA naprej (TGCTGCTCAACATCCTTGCC), GBA obratno (TAGGTGCGGATGGAGAAGTCAC), TFAM naprej (GGCAAGTTGTCCAAAGAAACC), TFAM obratno (GCATCTGGGTTCTGAGCTTTA), gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza (GAPDH) naprej (CAGCCTCAAGATCATC). AGCA) in GAPDH obratno (TGTGGTCATGAGTCCTTCCA).

Statistične analize so bile izvedene z uporabo programske opreme GraphPad Prism različice 9.3.1 (GraphPad Software, San Diego, CA, ZDA). Za primerjavo aritmetičnih sredin med dvema skupinama so bili uporabljeni dvostranski Studentovi t-testi. Podatki so predstavljeni kot srednje vrednosti in ± standardne napake srednjih vrednosti.

2.2. Imunofluorescenčna detekcija ektopične mitohondrijske DNA in analiza slike

En dan pred transfekcijo so bile celice HeLa posejane z gostoto 600 celic/µL. Ekspresija zanimivih genov je bila v celicah HeLa utišana z uporabo Stealth RNAi siRNA (Thermo Fisher Scientific) v reagentu za transfekcijo Lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher Scientific) v skladu z navodilih proizvajalca (končna koncentracija RNA 10 nM).

Tri dni po knockdownu siRNA so bile celice izpostavljene imunofluorescenčnemu obarvanju. Za odkrivanje mitohondrijske DNA, protitelesa proti dsDNA (Abcam, Cambridge, UK, klon 35I9, kat. št. ab27156, RRID: AB_470907 ali EMD Millipore, Billerica, MA, ZDA, klon AC-30-10 , Cat # CBL186, RRID: AB_11213573) je pokazal boljše razmerje med signalom in šumom kot Hoechst 33258, DAPI ali Picogreen. Tu smo združili tri primarna protitelesa: protitelo proti dsDNA (DNA 35I9) (Abcam, kat. št. ab27156, RRID: AB_470907), protitelo proti histonu H2B (Abcam, kat. št. ab134211) in protitelesa proti vročini. protitelo proti šok-proteinu-60 (Hsp60) (Abcam, kat. št. ab46798, RRID: AB_881444).

Izberemo lahko druga protitelesa ali jih fluorescentno označimo s histonom ali pa uporabimo alternativno Hsp60, vendar je treba optimizirati pogoje trojnega barvanja za vsako kombinacijo.

Celice smo dvakrat sprali s fosfatno pufrano fiziološko raztopino (PBS) in fiksirali z ledeno mrzlim metanolom 10 minuto pri 4 ◦C. Alternativno lahko za fiksacijo uporabimo 4 % paraformaldehid (PFA), vendar se zdi, da so signali iz ozadja veliko večji pri vzorcih s PFA. Po fiksaciji smo celice trikrat sprali s fosfatno pufrano fiziološko raztopino s Tween 20 (PBST) po 5 minut. Celice so bile permeabilizirane s PBS, ki je vseboval 0,2 % (m/v) Triton X-100 10 minut.

Po trikratnem izpiranju s PBST po 5 minut vsakič celice 30 minut inkubiramo z 2 % (m/v) govejega serumskega albumina (BSA) v PBST. Celice smo inkubirali z enim primarnim protitelesom, protitelesom proti histonu H2B (1/400, Abcam, kat. št. ab134211), razredčenim v 2 % (w/v) BSA v PBST O/N pri 4 °C. Po trikratnem izpiranju s PBST po 5 minut, so bile celice inkubirane z Alexa Fluor 488-AffiniPure Donkey anti-Chicken IgY(IgG) (H+L) (1/200, Wako, Cat# {{17) }}), razredčeno v 2 % (w/v) BSA v PBST 1 uro pri sobni temperaturi (RT).

Po trikratnem 5-minutnem izpiranju s PBST so bile celice inkubirane s primarnimi protitelesi in protitelesi proti dsDNA (35I9 DNA) (1/800, Abcam, kat. št. ab27156, RRID: AB_470907) in anti - Protitelesa Hsp60 (1/400, Abcam, Kat. št. ab46798, RRID: AB_881444), razredčena v 2 % (m/v) BSA v PBST, smo nanesli 1 uro pri sobni temperaturi ali čez noč (O/N) pri 4◦C.

Po trikratnem izpiranju s PBST po 5 minut so bile celice inkubirane z visoko navzkrižno adsorbiranim Alexa Fluor 680-konjugiranim Donkey anti-Rabbit IgG(H+L) (1/200, Thermo Fisher Scientific, Kat. št. A10043 , RRID: AB_2534018) ​​in Donkeyanti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor® 594) (1/200, Abcam Cat # ab150108, RRID: AB_2732073), razredčen v 2 % (w/v) BSA v PBST 1 uro pri sobni temperaturi.

Celice smo trikrat sprali s PBST po 5 minut in vzorec analizirali s konfokalnim mikroskopom A1R+ (Nikon, Tokio, Japonska).

For more information:1950477648nn@gmail.com