Trenutno stanje nevroprotekcije pri prirojenih srčnih napakah, 2. del

Mikroskopske slike so bile nato podvržene izračunu slike z uporabo programske opreme ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, ZDA). Signal Hsp60 je bil pomnožen z "x".

Hsp60 je pomembna beljakovinska molekula, ki igra pomembno biološko vlogo v človeškem telesu. Raziskave zadnjih let so pokazale, da je prisotnost Hsp60 tesno povezana s človeškim spominom.

Hsp60 je molekularni spremljevalni protein, ki je v glavnem vključen v zvijanje, odvijanje, stabilizacijo in razgradnjo beljakovin. Ti procesi so zelo pomembni za normalno presnovo in celično delovanje človeškega telesa. Hsp60 hkrati deluje tudi antioksidativno, protivnetno in imunomodulatorno ter ima veliko vlogo pri ohranjanju zdravja človeka in ravnovesja imunskega sistema.

Raziskave so pokazale, da ima Hsp60 ključno vlogo pri oblikovanju in vzdrževanju spomina. Med procesom učenja in spomina možganske celice proizvajajo veliko število molekul Hsp60. Te molekule lahko zaščitijo celice pred motnjami in poškodbami iz zunanjega okolja ter tako zagotovijo nemoten napredek učenja in spomina. Poleg tega lahko Hsp60 vpliva tudi na človeško razmišljanje in vedenje s spreminjanjem signalne transdukcije možganskih celic in razvoja nevronov ter pozitivno vpliva na kognicijo in odpornost na stres.

Čeprav je vloga Hsp60 pokazala pozitivne učinke na človeško telo, se morajo ljudje tudi zavedati, da ima lahko presežek in pomanjkanje Hsp60 negativne učinke na zdravje ljudi. Zato bi morali aktivno raziskovati in preučevati mehanizem Hsp60 v različnih fizioloških in patoloških stanjih človeškega telesa, da bi bolje razumeli položaj in vlogo Hsp60 v zdravju ljudi. Razvidno je, da moramo izboljšati spomin, in Cistanche deserticola lahko bistveno izboljša spomin, saj ima Cistanche deserticola antioksidativne, protivnetne učinke in učinke proti staranju, kar lahko pomaga zmanjšati oksidacijo in vnetne reakcije v možganih, s čimer ščiti zdravje živčnega sistema. Poleg tega lahko Cistanche deserticola spodbuja tudi rast in popravilo živčnih celic ter tako izboljša povezljivost in delovanje nevronskih mrež. Ti učinki lahko pomagajo izboljšati spomin, sposobnost učenja in hitrost razmišljanja ter lahko tudi preprečijo razvoj kognitivnih motenj in nevrodegenerativnih bolezni.

Kliknite Know za izboljšanje kratkoročnega spomina

Vrednost "x" je bila določena na naslednji način: z odštevanjem signala Hsp60, prepognjenega z "x" od signala mitohondrijske DNK v kontrolni skupini, je bila vrednost mitohondrijske DNK manjša ali enaka nič. Signal histona H2B je bil pomnožen z "y".

Vrednost "y" je bila določena na naslednji način: z odštevanjem signala "y" zloženega histona H2B od signala jedrske DNA v kontrolni skupini je bila vrednost jedrske DNA manjša ali enaka nič. Če signal ozadja zaradi množenja postane visok, se lahko kontrast pomnožene slike prilagodi za enake pogoje v vseh vzorcih.

Slika obarvanja z dsDNA, brez prilagojene slike pomnoženega Hsp60 in histona H2B, je bila uporabljena za nadaljnjo analizo. Z uporabo funkcije "Adjust-Threshold" so bile te slike binarizirane. Izbrali smo točke dsDNA velikosti od 2 do 20 µm2 (okrožnost 0,1–1,0) in jih prešteli s funkcijo "Analiza-analiziraj delce".

2.3. Elektronska mikroskopija

En dan pred transfekcijo so bile celice HeLa posejane z gostoto 600 celic/µL. Ekspresija zanimivih genov je bila v celicah HeLa utišana z uporabo Stealth RNAi siRNA (Thermo Fisher Scientific) v reagentu za transfekcijo Lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher Scientific) v skladu z navodilih proizvajalca (s končno koncentracijo RNA 10 nM).

Štiri dni po knockdownu siRNA smo celice izpostavili fiksaciji. Vzorce celične kulture smo fiksirali z 2 % PFA in 2 % glutaraldehida v 0.1 M fosfatnem pufru, pH 7,4, pri 37 ◦C, nato pa dali v 4 ◦C hladilnik za 30 min. Vzorce smo fiksirali v 2% glutaraldehidu v 0.1 M fosfatnem pufru čez noč pri 4 ◦C. Vzorce smo trikrat izpirali s 0.1 M fosfatnim pufrom 30 minut in naknadno fiksirali z 2 % osmijevim tetroksidom v 0,1 M fosfatnem pufru pri 4 ◦C 1 uro.

Vzorci so bili dehidrirane ingradirane raztopine etanola, preneseni v smolo (Quetol-812, Nisshin EM Co., Tokio, Japonska) in polimerizirani pri 60 ◦C 48 ur. Polimerizirane smole smo z ultramikrotomom (Ultracut UCT, Leica Microsystems, Wetzlar, Nemčija) z diamantnim nožem razrezali na ultratanke 70-nm rezine in jih nato namestili na bakrene mreže.

Sekcije smo obarvali z 2% uranil acetatom pri sobni temperaturi 15 minut in sprali z destilirano vodo, čemur je sledilo sekundarno obarvanje z raztopino za barvanje s svincem (Sigma-Aldrich, Tokio, Japonska) pri sobni temperaturi 3 minute.

Mreže so bile opazovane pod transmisijskim elektronskim mikroskopom (JEM-1400Plus, JEOL Ltd., Tokio, Japonska) pri pospeševalni napetosti 80 kV (možgani ribe cebrice) ali 100 kV (celica), slike pa so bile posnete s kamero z nabojno sklopljeno napravo (CCD) (EM-14830RUBY2, JEOL Ltd.) .

2.4. Imunoelektronska mikroskopija

Vzorci na zlatih diskih so bili zamrznjeni v tekočem propanu pri –175 ◦C. Ko so bili vzorci zamrznjeni, so bili z zamrzovanjem nadomeščeni z 1% taninske kisline v etanolu in 2% destilirane vode pri –80 ◦C za 24 ur.

Vzorce smo nato hranili pri –20 ◦C 4 ure, čemur je sledila inkubacija pri 4 ◦C 1 uro. Nato smo vzorce dehidrirali v brezvodnem etanolu 3-krat 30 minut. vsakič, čemur sledi infiltracija z mešanico etanola in smole 50:50 (LR bela: London Resin Co. Ltd., Berkshire, Združeno kraljestvo) pri 4 ◦C 1 uro. Vzorce smo prenesli v svežo 100% smolo in inkubirali pri 4 ◦C 30 minut, ta postopek pa smo ponovili trikrat.

Vzorce smo prenesli na svežo 100 % smolo in polimerizirali pri 50 ◦CO/N. Polimerizirane smole so bile ultratanko razrezane pri 90 nm z diamantnim nožem z ultramikrotomom (Ultracut UCT; Leica), rezine pa so bile nameščene na nikljeve mreže. Mreže so bile inkubirane s protitelesom proti dsDNA (35I9 DNA) (1/800, Abcam, kat. št. ab27156, RRID: AB_470907) v 1 % BSA/PBS pri 4 °CO/N, čemur so sledila trikratna izpiranja z 1 % BSA/PBS 1 minuto vsakega.

Nato so jih inkubirali s temi sekundarnimi protitelesi, konjugiranimi z {{0}}nm zlatimi delci (kozje anti-mišje IgG poliklonsko protitelo) 2 uri pri RT. Po izpiranju s PBS so bile mreže postavljene v 2% glutaraldehidin 0,1 M kakodilatni pufer.

Nato so bile mreže posušene in nato 15 minut obarvane z 2 % uranil acetatom in 3 minute z raztopino svinčenega barvila (Sigma-Aldrich) pri sobni temperaturi. Mreže so bile opazovane s transmisijskim elektronskim mikroskopom (JEM-1400 plus; JEOLLtd.) pri pospeševalni napetosti 100 kV. Digitalne slike so bile pridobljene s kamero CCD (EM-14830RUBY2, JEOL Ltd.).

3. Rezultati

3.1. Zmanjšan TFAM ali GBA povzroči povečanje ektopične mitohondrijske DNA

Najprej smo pokazali primer odkrivanja citoplazmatske DNA, pridobljene iz mitohondrijev, v celicah HeLa, v katerih je protein TFAM podrl siRNA (slika 1A). TFAM je ključni mitohondrijski transkripcijski faktor in deluje tudi pri replikaciji in popravljanju mitohondrijske DNA [20] .

Poročajo, da so sekvencni polimorfizmi v tem genu povezani s Parkinsonovo boleznijo [21, 22]. Po 3 dneh knockdowna proteina TFAM je bilo v citoplazmi celic HeLa odkritih veliko pik dvoverižne DNK.

Histoni so pozitivni označevalci za DNK jedrskega izvora v citoplazmi in negativni označevalci za mitohondrijsko DNK in DNK mitohondrijskega izvora v citoplazmi [23]. Te pike se niso lokalizirale skupaj s histoni, kar nakazuje, da niso DNK jedrskega izvora. Poleg tega se nekatere od teh citoplazemskih ektopičnih pik DNK niso lokalizirale skupaj s Hsp60, markerjem za mitohondrijski matriks, kar kaže, da so prebivale zunaj mitohondrijev (slika 1B, C).

Elektronska mikroskopija je tudi pokazala, da je ektopična DNK uhajala iz mitohondrijev (slika 2A, B). Če povzamemo, je bilo povečanje ektopičnih pik DNA v citoplazmi zaradi knockdowna TFAM posledica uhajanja mitohondrijske DNA iz mitohondrijev. Drugič, pokazali smo še en primer odkrivanja citoplazemske DNA, pridobljene iz mitohondrijev, v celicah HeLa, v katerih je protein GBA podrl siRNA (Slika 1A).

GBA je vzročni gen za Gaucherjevo bolezen, vendar je heterozigotna mutacija GBA tudi dejavnik tveganja za Parkinsonovo bolezen [24]. V citoplazmi celic HeLa so po 3 dneh uničenja proteina GBA odkrili veliko pik dvoverižne DNK. Nekatere pike DNK so bile lokalizirane skupaj s histoni, kar nakazuje, da gre za jedrsko DNK.

Druge pike DNK niso bile so-lokalizirane s histoni, kar nakazuje, da niso DNK, pridobljena iz jedra, temveč DNK, pridobljena iz mitohondrijev (slika 1D). Če povzamemo, je bilo povečanje ektopičnih pik DNK v citoplazmi zaradi izpada GBA vsaj delno posledica uhajanja mitohondrijske DNK iz mitohondrijev.

For more information:1950477648nn@gmail.com