Učinek tropisetrona na oksidativni stres, SIRT1, FOXO3a in Claudin-1 v ledvičnem tkivu diabetičnih podgan, ki jih povzroča STZ

edmund.chen@wecistanche.com

Povzetek

Tropisetron je 5-antagonist receptorjev HT3, ki ima zaščitni učinek proti DN. Namen te študije je bil raziskati možne molekularne mehanizme, povezane z renoprotektivnimi učinki tropisetrona pri diabetičnih podganah, ki jih povzroča STZ. Živali so bile razdeljene v 5 enakih skupin; nadzor, tropisetron, diabetes, tropisetron plus diabetes in glibenklamid plus diabetes (n=7). Za indukcijo sladkorne bolezni tipa 1 smo živalim dali eno samo injekcijo STZ (55 mg/kg, ip). Podgane s sladkorno boleznijo so 2 tedna zdravili s tropisetronom (3 mg/kg) in glibenklamidom (1 mg/kg). Po opravljeni analizi je sladkorna bolezen privedla doledvična disfunkcijo (zmanjšanje hitrosti glomerulne filtracije ter sečnine in kreatinina v urinu ter zvišanje sečnine in kreatinina v plazmi) in nepravilnosti v antioksidativnem obrambnem sistemu (zmanjšanje TAC in zvišanje MDA) v primerjavi s kontrolno skupino, ki so jo preprečili s tropisetronom zdravljenje. Verižna reakcija polimeraze s kvantitativno reverzno transkripcijo in Western blotting analiza sta pokazali, da se je ekspresija gena SIRT1 zmanjšala, medtem ko se je ekspresija gena FOXO3a in NF-κB ter razmerje med fosforiliranim FOXO3a/celotnim proteinom FOXO3a in raven beljakovine claudin-1 povečala vledvicadiabetičnih podgan v primerjavi s kontrolno skupino. Tu so rezultati te raziskave pokazali, da je zdravljenje s tropisetronom obrnilo te spremembe. Poleg tega so vse te spremembe primerjali s tistimi, ki jih povzroči glibenklamid kot pozitivna kontrola. Zato se je tropisetron izboljšalpoškodbe ledviczaradi diabetične nefropatije, po možnosti z zaviranjem oksidativnega stresa in spremembo ravni SIRT1, FOXO3a in claudina-1.

Ključne besede:poškodbe ledvic; delovanje ledvic; ledvična bolezen; ledvice; ledvična tkiva

CISTANCHE BO IZBOLJŠAL LEDVIČNO/LEDVIČNO OKVARJO

Uvod

Diabetična nefropatija (DN) je mikrovaskularna bolezen, za katero je značilna čezmerna proteinurija z obolevnostjo 25–40 odstotkov (Chen et al. 2011; Ritz et al. 2010). Morfološke in funkcionalne spremembe, vključno s hipertrofijo glomerulov, čezmernim kopičenjem zunajceličnega matriksa in glomerulosklerozo ter končno izgubodelovanje ledvicvledvicaso povezani s hiperglikemijo in posledično motnjo presnove glukoze (Kanwar et al. 2008; Vikram et al. 2014). Zato je bila posebna pozornost namenjena učinkovitemu obvladovanju ali zdravljenju, ki je morda potrebno za boj proti bolezni v zgodnji fazi. Kopiči se dokazi, ki kažejo, da sta nastajanje reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS) kot neposredni vzrok hiperglikemije in posledično nastajanje vnetnih citokinov glavna mehanizma pri razvoju zapletov sladkorne bolezni (Beckman in Ames 1998; Giacco in Brownlee 2010; Jaimes et al. 2010). ; Kiritoshi et al. 2003). Očitno je, da neravnovesje med prooksidantno in antioksidativno obrambno zmogljivostjo povzroči kopičenje prostih radikalov, ki lahko poškodujejo celične makromolekule, vključno z DNK, ter modifikacijo beljakovin in lipidno peroksidacijo (Peluso in Raguzzini 2016).

Sirtuini sesalcev so družina NAD plus odvisnih deacetilaz, vključno s sedmimi člani (SIRT1-7). Med njimi je bil najobsežneje raziskan SIRT1, prvi član družine (Dong et al. 2014). Nedavne študije so pokazale, da ima SIRT1 pomembno vlogo pri uravnavanju celične smrti/dolgoživosti ter akutnega in kroničnega stresnega odziva pri sesalcih z zmanjšanjem poškodb DNK, vnetja in apoptoze (Hasegawa et al. 2013; Yun et al. 2012). ). Številne študije kažejo na višje ravni zmanjšane regulacije aktivnosti SIRT1 pri diabetikih, ki jo povzroči ROS.ledvice,tako in vivo kot in vitro (Akhtar in Siragy 2019; Du et al. 2016; Kumar et al. 2014; Papadimitriou et al. 2015; Park et al. 2016; Shi in Huang 2018).

SIRT1 lahko izvaja svoje delovanje z uravnavanjem več proteinov, kot so transkripcijski faktorji jedrnega faktorja kappaB (NF-κB) in družine FOXO (Brunet et al. 2004; Langley et al. 2002; Motta et al. 2004; Yeung et al. 2004). Pred kratkim je bilo ugotovljeno, da SIRT1 uravnava presnovo glukoze s prispevanjem k FOXO (Kobayashi et al. 2005). FOXO3a je podskupina družine transkripcijskih faktorjev FOXO, ki imajo pomembno vlogo med oksidativnim stresom (Accili in Arden 2004). Spremembe FOXO3a nastanejo s fosforilacijo in acetilacijo, ki se lahko pojavita hkrati v različnih pogojih. Glede na literaturo lahko SIRT1 deacetilira FOXO3a, s čimer poveča njegovo vseprisotnost in zaščiti pred stresorji (Wang et al. 2017a). Malo je informacij o mehanizmu interakcij med SIRT1 in FOXO med hiperglikemičnimi stanji (Yun et al. 2012). Vendar pa je bilo predlagano, da SIRT1 modulira aktivnost FOXO verjetno z njihovo jedrsko translokacijo (Brunet et al. 2004) in tudi nadzoruje gensko specifično transkripcijo (Kobayashi et al. 2005). Zato je translokacija FOXO3a iz citoplazme v jedro v glavnem posledica deacetilacijske aktivnosti SIRT1, zlasti v statusu oksidativnega stresa (Yun et al. 2012).

Wang et al. poročali, da je zdravljenje z visoko glukozo moduliralo ekspresijo beljakovin SIRT1 in FOXO3a pri ljudehledvicaepitelijskih celic (Wang et al. 2017b). Poleg tega FOXO3a deluje kot pozitivni regulator signalizacije NF-κB, v katerem bi ga lahko uporabili za vplivanje na strategije preživetja celic v stresnih pogojih (Li et al. 2012). Claudin-1 je domnevni marker, specifičen za parietalne epitelijske celice (PEC) (Huby in sod. 2009; Ohse in sod. 2009; Rincon-Choles in sod. 2006), ki je negativno povezan z izražanjem SIRT1 v obeh proksimalnih tubulih in glomerularni regiji. Pokazalo se je, da znižanje regulacije SIRT1 pri sladkorni bolezni potrjuje regulacija proteina tesnega stika claudin-1 v podocitih, ki prispevajo k albuminuriji (Gong et al. 2017; Hasegawa et al. 2013). Ker so oksidativni stres, vnetni citokin in njihovi molekularni mediatorji glavne teme pri škodljivih učinkih sladkorne bolezni, bi lahko antioksidanti in protivnetna sredstva zagotovili nove terapije proti DN (Elmarakby in Sullivan 2012).

Tropisetron je nedavno nastajajoči 5-antagonist receptorjev HT3, ki je bil identificiran kot antiemetično zdravilo med kemoterapijo (Barzegar-Fallah et al. 2015). Več poročil je pokazalo, da lahko tropisetron nudi antiapoptotične, antidiabetične, protirakave, antilipidemične, nevroprotektivne in kardioprotektivne učinke, ki so verjetno posredovani z antioksidativnimi in protivnetnimi mehanizmi (Aminzadeh 2017; Asadi et al. 2016; Barzegar-Fallah et al. 2015; Barzegar-Fallah et al. 2014; Gholizadeh-Ghaleh Aziz et al. 2019; Rashidi in Bazi 2020). Obstaja nekaj študij, ki dokazujejo antioksidativni učinek tropisetrona, tako in vitro kot in vivo, kot je zaščitni učinek tropisetrona na oksidativne motnje v celicah PC12, ki jih povzroči hiperglikemija (Aminzadeh 2017), izboljšanje mitohondrijske poškodbe z znižanjem nitrergičnega sistemske aktivnosti v možganih (Haj Mirzaian et al. 2016) ali zmanjšanje oksidativnega stresa proti staranju možganov pri miših (Mirshafa et al. 2020).

Pred kratkim sta Barzegar Fallah et al. je razkrilo, da tropisetron izboljša glukozo v krvi in ​​tudidelovanje ledvickot je razvidno iz znižanja dušika sečnine v serumu (BUN), ravni serumskega kreatinina in izločanja albumina v urinu. Poleg tega so bile aktivnosti vsebnosti malondialdehida (MDA), ravni glutationa (GSH), aktivnosti superoksid dismutaze (SOD) in katalaze (CAT). izboljšalo pri živalih s sladkorno boleznijo, zdravljenih s tropisetronom (Barzegar-Fallah et al. 2015). Vendar pa ni drugih trdnih dokazov o modulaciji DN s tropisetronom in njegovem molekularnem mehanizmu. Cilj te študije je torej najprej oceniti: učinke tropisetrona na molekularne mediatorje, vključno s SIRT1, NF-κB in FOXO3a, ter klaudinom-1, ki je protein, ki sodeluje pri tesnih epitelnih stikih in igra glavno vlogo vledvičnadiabetična nefropatija; drugič, primerjati učinek tropisetrona s standardnim trženim antidiabetikom, glibenklamidom, da bi našli bolj koristno in varno sredstvo kot zlati standard antidiabetika.

CISTANCHE BO IZBOLJŠAL LEVIČNE/LEDVIČNE BOLEZNI

Materiali in metodeTa študija je bila izvedena v skladu z načeli oskrbe laboratorijskih živali Univerze medicinskih znanosti Urmia. Etična odobritev je bila dosežena na podlagi Direktive EU 2010/63/EU za poskuse na živalih v skladu s smernicami Odbora za medicinsko etiko, Ministrstvo za zdravje, Iran (IR.UMSU.REC.1397.291). Petintrideset podganjih samcev Wistar (teža 230–270 g, starost 3–4 mesece) je bilo razdeljenih v 5 skupin (v vsaki skupini sedem podgan): 1. Kontrolna skupina: Podgane so 2 tedna prejemale normalno fiziološko raztopino intraperitonealno. 2. Skupina s tropisetronom: Podgane so prejemale tropisetron intraperitonealno 2 tedna. 3. Skupina s sladkorno boleznijo: Diabetes je bil induciran z injekcijo streptozotocina (STZ) pri podganah. 4. Skupina s tropisetronom in sladkorno boleznijo: Podgane so prejemale 3 mg/kg tropisetrona (Gholizadeh-Ghaleh Aziz et al. 2019) intraperitonealno 2 tedna po indukciji sladkorne bolezni. 5. Skupina z glibenklamidom in sladkorno boleznijo: Podgane so prejemale 1 mg/kg glibenklamida (Gholizadeh-Ghaleh Aziz et al. 2019) intraperitonealno 2 tedna po indukciji sladkorne bolezni.

Indukcija sladkorne bolezniStreptozotocin (50 mg/kg) je bil intraperitonealno injiciran v enem samem odmerku za induciranje sladkorne bolezni pri podganah. Na podlagi te metode je bila pri podganah 72 ur po injiciranju inducirana sladkorna bolezen tipa I. Sladkorno bolezen so diagnosticirali in potrdili tako, da so z lanceto povzročili manjšo poškodbo v repu podgan na tešče, nato pa so na trak glukometra dali kapljico krvi. Nato so ga izmerili z glukometrom (Boehringer Mannheim Indianapolis, IN), ravni glukoze v krvi nad 300 mg/dl pa so veljale za indikator indukcije sladkorne bolezni. Po 2 tednih in 24 urah pred anestezijo so podgane eno za drugo postavili v presnovne kletke in zbrali urin. Nato smo vzorce urina takoj centrifugirali s prozorno površino vzorcev, shranjeno pri –20 stopinjah za analizo sečnine in kreatinina. Nato smo podgane stehtali in anestezirali z intraperitonealno injekcijo mešanice ketamina (60 mg/kg) in ksilazina (4 mg/kg). Nato se je odprla trebušna votlina; kri smo vzeli iz srca z ozko brizgo in zmešali z etilendiamintetraocetno kislino (EDTA) ter centrifugirali pri 4000 × g 20 minut. Nato je bila dobljena plazma shranjena pri -80 stopinjah za poznejše merjenje sečnine, kreatinina in skupne antioksidativne kapacitete (TAC). Obojeledviceživali so izrezali, sprali s hladnim fiziološkim serumom in stehtali. Levaledvicatkiva smo homogenizirali z Ultra Turrax (T10B, IKA in Nemčija) v raztopini, ki vsebuje RNAase, da bi testirali nivoje izražanja SIRT1, NF-κB in FOXO3a z uporabo metode PCR v realnem času. Pravledvicaje bil zamrznjen pri –80 stopinjah za merjenje MDA in Western blot analizo (celotni in fosforilirani FOXO3a in claudin-1).

Glukoza v krvi na teščeNa koncu protokola, po nočnem postu (14 do 18 ur), so bili odvzeti vzorci krvi s konice repa, nato pa so bile z uporabo digitalnega glukometra (Elegance, CT-X10, Frankenberg, Nemčija) izmerjene ravni glukoze.Sečnina in kreatinin v urinu in plazmiV ta namen bodo ravni sečnine in kreatinina v urinu in plazmi izmerjene s posebnimi ekonomskimi kompleti za merjenje sečnine in kreatinina (Biotechnical; Varginha, Minas Gerais, Brazilija).Stopnja glomerularne filtracijeHitrost glomerularne filtracije (GFR) je najboljši splošni indeksdelovanje ledvic, ki je bil ovrednoten z izračunom očistka kreatinina (GFR=[UCr × V]/SCr) in uporabo koncentracije kreatinina v plazmi in urinu ter hitrosti ali volumna urina.

Malondialdehid in skupna antioksidativna kapacitetaMDA kot končni produkt peroksidacije lipidov je bil ocenjen z reakcijo s tiobarbiturno kislino (Sigma-Aldrich; ZDA) vledvicavzorce v skladu s protokolom proizvajalca (Esterbauer in Cheeseman 1990). Na kratko, 0.3–0,4 gledvičnega tkivahomogenizirali v ledeno mrzlem KCl (15 0 mM) in nato centrifugirali pri 3000 × g 10 minut. Nato smo 0,5 ml supernatanta združili s 3 ml fosforne kisline (1 odstotek, v/v) in po vrtinčnem mešanju vzorcem dodali 2 ml 6,7 g/l TBA. Vzorce smo segrevali pri 100 stopinjah 45 minut. Po ohlajanju na ledu združimo n-butanol (3 ml) in produkte nadalje centrifugiramo pri 3000 × g še 10 minut. Nato smo s spektrofotometrijo upoštevali absorbanco produktov pri 532 nm. Nivo absorbance smo primerjali s standardno krivuljo. TAC je bil izmerjen s kompletom Randox za celotno antioksidativno stanje, v katerem je ABTS 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonat) inkubiran s peroksidazo in H2O2, kar ima za posledico proizvodnjo radikalnega kationa ABTS plus . Ima stabilno modro-zeleno barvo, ki se ovrednoti z 600-nm avtomatskim analizatorjem (Amini et al. 2020).

CISTANCHE BO IZBOLJŠAL LEDVIČNE/LEDVIČNE BOLEČINE

Oblikovanje primerja in PCR v realnem časuRNA je bila najprej ekstrahirana z ustreznim kompletom (GENALL), kondenzirana RNA pa je bila kvalitativno (elektroforeza) in kvantitativno (nano-kapljica) ocenjena, da se zagotovi ekstrakcija RNA in uporaba v nadaljnjih molekularnih tehnikah. Nato je bila ustrezna cDNA sintetizirana iz vseh ekstrahiranih vzorcev RNA. Primerji ciljnih genov in gen za gliceraldehid dehidrogenazo (GAPDH) kot hišni gen so bili pregledani na mestu NCBI z uporabo programske opreme Generunner (dodatna tabela). Nato smo gensko ekspresijo analizirali z uporabo sintetiziranih primerjev s kompletom PCR, čemur je sledila statistična analiza podatkov.

Western blotWestern blot metoda je bila uporabljena za določanje ravni FOXO3a (celotne in fosforilirane) in klaudin-1 beljakovin vledvica.Za izdelavo gela za elektroforezo se uporabljata dva gela za ločevanje in zlaganje. Po pripravi gela za raztapljanje in njegovem vlivanju v kalup smo po eni uri in po zlaganju dodali gel za zlaganje. Vzorce smo naložili v jamice, narejene s posebnim glavnikom. Potem jih je ločila SDS-PAGE. V eni uri so bili vsi naloženi vzorci preneseni na PVDF membrano. Nato so bili vzorci blokirani s 5-odstotnim pufrom posnetega mleka, vključno z 0,1-odstotnim Tweenom 20, in nato inkubirani s primarnimi protitelesi čez noč pri 4 stopinjah v stresalnem inkubatorju. Nato so bile membrane inkubirane s sekundarnim protitelesom, konjugiranim s hrenovo peroksidazo. Končno je bil beta-aktin uporabljen kot interni standard za Western blot analizo. Na koncu smo na radiografskem filmu v temnem prostoru ovrednotili učinke pobarvanih vzorcev, odvisno od ravni tarčnega proteina. Za kvantifikacijo ciljnih proteinov so bili rezultati skeniranja filma izračunani z denzitometrom glede na raven aktina. Protitelesa, uporabljena v Western blotting testih, so prikazana v dodatni tabeli (kataloške številke in podjetja).

Statistična analizaRezultati so bili predstavljeni kot povprečje ± SEM. Statistična analiza je bila izvedena s programom SPSS 16.0. Primerjava med skupinami je bila ocenjena s testom ANOVA, ki mu je sledil Tukeyjev post hoc test. Za razlike se domneva, da so statistično značilne pri P <>

Rezultati

Tropisetron je zmanjšal glukozo v krvi na tešče (mg/dl), težo ledvic (g) in ledvični indeks (mg/g), medtem ko je povečal telesno težo (g) pri podganah s sladkorno boleznijo, povzročenih s STZ.Podobno kot v prejšnjih študijah v tem delu so diabetične skupine pokazale hudo (P < {{0}}.001)="" hiperglikemijo="" v="" primerjavi="" s="" kontrolno="" skupino.="" dvotedensko="" uživanje="" tropisetrona="" (p="">< 0,01)="" in="" glibenklamida="" (p="">< 0,05)="" je="" pomembno="" znižalo="" glukozo="" v="" krvi="" v="" skupinah="" s="" sladkorno="" boleznijo,="" povzročenih="" s="" stz,="" vendar="" je="" bilo="" še="" vedno="" značilno="" višje="" kot="" v="" kontrolni="" skupini="" (p="">< 0,001="" ).="" na="" začetku="" te="" študije="" ni="" bilo="" bistvene="" razlike="" v="" telesni="" teži="" (tt)="" med="" skupinami="" (podatki="" niso="" prikazani).="" indukcija="" sladkorne="" bolezni="" s="" stz="" se="" je="" znatno="" zmanjšala="" (p=""><0,001) končno="" (bw)="" pri="" diabetičnih="">Ledvicateža (KW) med skupinami sprva ni bila pomembna; vendar je bil povečan v skupini diabetikov in zmanjšan po posegih.Ledvica(KW/TT) je bil znatno povečan (P < {{0}}.001)="" pri="" t1dm="" v="" primerjavi="" s="" kontrolno="" skupino.="" zanimivo="" je,="" da="" se="" je="" po="" 2="" tednih="" uporabe="" tropisetrona="" in="" glibenklamida="" modulirala="" kw/bw="" (p=""><0,05) (tabela="">

Tropisetron je izboljšal biokemijsko analizo pri podganah s sladkorno boleznijo, povzročenih s STZTako kot v prejšnjih študijah so bile ravni sečnine v plazmi in urinu diabetične skupine znatno višje od tistih v kontrolni skupini (P < {{0}}.001)="" .="" v="" skupini="" s="" tropisetronom="" in="" sladkorno="" boleznijo="" plazma="" (p="">< 0.{{10}}01)="" in="" urin="" (p="">< 0.0="" 5)="" ravni="" sečnine="" so="" se="" znatno="" znižale="" v="" primerjavi="" s="" tistimi="" v="" skupinah="" s="" sladkorno="" boleznijo.="" vendar="" je="" bila="" sečnina="" v="" urinu="" še="" vedno="" bistveno="" nižja="" kot="" v="" kontrolni="" skupini="" (p=""><0,01). med="" tropisetronom="" in="" sladkorno="" boleznijo="" in="" kontrolnimi="" skupinami="" ni="" bistvene="" razlike="" v="" ravni="" sečnine="" v="" plazmi.="" raven="" kreatinina="" v="" plazmi="" (p=""><0,001) in="" urinu="" (p=""><0,05) je="" pri="" diabetičnih="" podganah="" pokazala="" znatno="" povečanje="" v="" primerjavi="" s="" tisto="" v="" kontrolni="" skupini.="" dajanje="" tropisetrona="" je="" v="" primerjavi="" s="" skupino="" diabetikov="" pomembno="" znižalo="" koncentracijo="" kreatinina="" v="" urinu="" in="" plazmi="" (p=""><0,001). pri="" živalih="" s="" sladkorno="" boleznijo="" je="" bil="" očistek="" kreatinina="" kot="" pokazatelj="" hitrosti="" glomerulne="" filtracije="" pomembno="" nižji="" kot="" pri="" kontrolni="" skupini="" (p="">< 0,05).="" zdravljenje="" s="" tropisetronom="" je="" pomembno="" povečalo="" očistek="" kreatinina="" v="" primerjavi="" s="" tistim="" v="" skupini="" s="" sladkorno="" boleznijo="" (p="">< 0,001).="" enake="" rezultate="" so="" dobili="" v="" skupini,="" zdravljeni="" z="" glibenklamidom.="" vendar="" pa="" je="" sečnina="" v="" plazmi="" veliko="" nižja="" v="" skupini,="" zdravljeni="" s="" tropisetronom,="" v="" primerjavi="" s="" skupino,="" ki="" je="" prejemala="" glibenklamid="" in="" sladkorno="" bolezen="" (p="">< 0,01)="" (tabela="">

Tropisetron je povečal vsebnost TAC v plazmi in zmanjšal raven MDA pri podganah s sladkorno boleznijo, ki jih povzroča STZRaven MDA v kontrolni skupini, tropisetronu, sladkorni bolezni, tropisetronu in sladkorni bolezni ter glibenklamidu in sladkorni bolezni je bila 8,65 ± 1.01, 10.89 ± 1.6 35.54 ± 7,1, 18,76 ± 3,6 oziroma 16,89 ± 4,1 nmol/mg beljakovin. Naša študija je skupaj s tistimi drugih pokazala najvišjo raven MDA v skupini s sladkorno boleznijo, ki je pokazala znatno povečanje v primerjavi s kontrolno skupino (P < 0.00="" 1).="" raven="" mda="" v="" skupinah="" s="" tropisetronom="" in="" sladkorno="" boleznijo="" ter="" glibenklamidom="" in="" s="" sladkorno="" boleznijo="" je="" pokazala="" znatno="" zmanjšanje="" (p="">< {{30}}.01)="" v="" primerjavi="" s="" skupino="" s="" sladkorno="" boleznijo="" (slika="" 1a).="" ravni="" tac="" v="" kontrolni="" skupini,="" tropisetronu,="" sladkorni="" bolezni,="" tropisetronu="" in="" sladkorni="" bolezni="" ter="" glibenklamidu="" in="" sladkorni="" bolezni="" so="" bile="" 0.65="" ±="" 0.{{40}}3,="" {{44}="" },76="" ±="" 0,06,="" 0,26="" ±="" 0,08,="" 0,45="" ±="" 0,06="" oziroma="" 0,57="" ±="" 0,08="" nmol/ml.="" ravni="" tac="" so="" se="" zmanjšale="" v="" skupini="" s="" sladkorno="" boleznijo="" v="" primerjavi="" s="" tistimi="" v="" kontrolni="" skupini="" (p=""><0,001), kot="" je="" prikazano="" prej.="" tako="" dajanje="" tropisetrona="" kot="" glibenklamida="" je="" znatno="" (p=""><0,01) povečalo="" plazemske="" ravni="" tac="" pri="" živalih="" s="" sladkorno="" boleznijo="" v="" primerjavi="" s="" skupino="" s="" sladkorno="" boleznijo="" (slika="">

Tropisetron je povečal SIRT1 in zmanjšal ekspresijo genov FOXO3a in NF-κB Genske ekspresije so bile ovrednotene s PCR v realnem času, kar je zagotovilo pomembne dokaze o razlikah med skupinami. V skladu s tem je bila sladkorna bolezen povezana s pomembnim zmanjšanjem (0.65 ± 0.08) izražanja gena SIRT1 (P < 0.01="" )="" in="" znatno="" povečanje="" (p="">< 0.001)="" v="" foxo3a="" (1,98="" ±="" 0.08)="" in="" nf-κb="" (1,71="" ±="" 0.14)="" izražanje="" genov="" v="" primerjavi="" s="" kontrolno="" skupino.="" zdravljenje="" s="" tropisetronom="" je="" povečalo="" sirt1="" (0,88="" ±="" 0,3)="" in="" znatno="" znižalo="" ravni="" mrna="" foxo3a="" (1,53="" ±="" 0,08)="" (p="">< 0,05)="" in="" nf-κb="" (1,27="" ±="" 0,03)="" (p="">< 0,01)="" pri="" diabetičnih="" podganah="" (slika="" 2a–c).="" podobne="" rezultate="" so="" dobili="" pri="" živalih,="" zdravljenih="" s="" standardnim="" zdravilom,="">

Tropisetron je zmanjšal izražanje beljakovin FOXO3a in claudin-1Za ovrednotenje izražanja FOXO3a (celotnega in fosforiliranega) in claudin- 1 proteina po zdravljenju s tropisetronom in glibenklamidom je bil uporabljen Western blotting vledvicarazličnih skupin. Analiza podatkov kaže znatno povečanje razmerij fosforiliranega FOXO3a/skupnega proteina FOXO3a (4,6 ± 0.17) in klaudina-1 (3.02 ± 0.16 ) ravni beljakovin v skupini diabetikov v primerjavi s kontrolo (P < 0.001).="" dajanje="" tropisetrona="" je="" izrazito="" zmanjšalo="" razmerje="" med="" fosforiliranim="" foxo3a/celotnim="" proteinom="" foxo3a="" (2,14="" ±="" 0,31)="" in="" ravni="" klavdina-1="" (2,4="" ±="" 0,12)="">ledvicadiabetičnih podgan (P < {{0}}.01).="" zdravljenje="" z="" glibenklamidom="" je="" pomembno="" oslabilo="" tako="" razmerje="" med="" fosforiliranim="" foxo3a/celotnim="" proteinom="" foxo3a="" (2,57="" ±="" 0,5)="" (p="">< 0,001)="" kot="" klaudinom-1="" (2,2="" ±="" 0,11)="" (p="">< 0,05="" )="" ravni="" beljakovin="" pri="" podganah="" s="" sladkorno="" boleznijo,="" ki="" jih="" povzroča="" stz="" (sl.="">

Diskusija Ugotovitve trenutne študije so podane v naslednjih razdelkih: enkratna injekcija STZ-induciranega T1DM je bila povezana s hudo hiperglikemijo, izgubo teže inledvicadisfunkcijo, ki se kaže z izrazitim zvišanjem kreatinina in sečnine v plazmi ter izrazitim zmanjšanjem očistka kreatinina kot indeksa GFR v primerjavi s tistim v kontrolni skupini. STZ poruši oksidativno ravnovesje vledvicatkiva, kar je bilo dokazano s povečanjem MDA in znižanjem vsebnosti TAC. Nadaljnja molekularna analiza je pokazala, da je sladkorna bolezen zmanjšala mRNA SIRT1 in povečala mRNA NF-κB ter razmerja med fosforiliranim FOXO3a/skupnim proteinom FOXO3a in raven beljakovine claudin-1 vledvicapodganjih samcev. Znatno izboljšanje sečnine, kreatinina, kreatinina

očistek, kot tudi SIRT1 mRNA, NF-κB mRNA, razmerja med fosforiliranim FOXO3a/celotnim proteinom FOXO3a in proteinom claudin-1, podobno kot pri kontrolnih živalih, so opazili v skupini s tropisetronom in sladkorno boleznijo. DN, za katero je značilno več značilnosti, kot so motnje vledvičnastrukturna in funkcionalna celovitost, povečanje vledvicavelikost, kot tudi glomerularna in tubularna hipertrofija, je glavni vzrok za končno fazoledvična bolezen(Singh et al. 2018; Yaribeygi et al. 2018). Progresivna albuminurija, zmanjšana GFR in zvišanje arterijskega krvnega tlaka so najbolj izraziti funkcionalni simptomi, opaženi pri bolnikih s sladkorno boleznijo (Alzahrani et al. 2020). Najzgodnejši označevalec DN je albuminurija, ki nastane zaradi progresivne poškodbe glomerulov kot osrednje značilnosti pri začetkupoškodba ledvic(Elsherbiny et al. 2018). V skladu z našimi ugotovitvami so prejšnje študije poudarile, da DN spremljajo povečanja serumskega kreatinina in sečnine, kar kaže na disfunkcijoledvičnega tkiva(Sharma et al. 2006; Tang et al. 2018).

Kopičenje dokazov kaže, da je nastajanje prostih radikalov zaradi hiperglikemije ključni dogodek pri nastanku in napredovanju diabetičnih mikrovaskularnih zapletov, vključno z DN. Prekomerna proizvodnja ROS prispeva k oksidativnim poškodbam z vplivom na makromolekule, celice in tkiva ter ima za posledico nepopravljive poškodbe ali funkcionalne motnje (Kiritoshi et al. 2003).

MDA kot označevalec lipidne peroksidacije sproži napad prostih radikalov na membranske nenasičene maščobne kisline, ki so prispevale k zapletom pri sladkorni bolezni (Pieme et al. 2017). Skupni antioksidativni status je bil ocenjen s TAC, ki je biomarker za določanje oksidativnega stresa v številnih patoloških stanjih. Tako okvare MDA in TAC pri bolnikih s sladkorno boleznijo odražajo nastajanje prostih radikalov, ki povzročajo status oksidativnega stresa (Peluso in Raguzzini 2016). Dosledno so rezultati te študije pokazali povečan MDA in znižan TAC pri podganah s sladkorno boleznijoledvica. Glede na to dejstvo je oslabitev oksidativnega stresa ublažila diabetične zaplete, vključno zpoškodba ledvic(Alzahrani et al. 2020; Barzegar-Fallah et al. 2015).

Tropisetron kot 5-antagonist HT3 z antioksidativnim in protivnetnim delovanjem kaže zaščitne učinke pri številnih patoloških stanjih, kot je sladkorna bolezen (Barzegar-Fallah et al. 2015; Rashidi in Bazi 2020). Nefroprotektivni učinek tropisetrona je bil predhodno opisan v poskusih na živalih. V tem pogledu je tropisetron izboljšal DN na 5-od receptorja HT3 neodvisen način s preprečevanjem povečane glukoze v krvi,ledvičnaRavni MDA, CAT, SOD, Gpx in TNF ter zmanjšano izločanje citokinov z urinom in albuminurija (Barzegar-Fallah et al. 2015).

V skladu s tem vprašanjem so v trenutni preiskavi predloženi dokazi, ki kažejo, da je tropisetron moduliral hiperglikemijo, izgubo teže in stanje oksidativnega stresa, kar se kaže z zmanjšanjem MDA in povečanjem vsebnosti TAC ter izboljšanjemledvicadisfunkcija (znatno zmanjšanje sečnine in kreatinina v plazmi). Glibenklamid je bil v skladu s predhodnimi študijami uporabljen kot standardno zdravilo (Amini et al. 2020). Zanimivo je, da v skupini, ki je prejemala glibenklamid, in skupini, ki je prejemala tropisetron, v omenjenih parametrih niso opazili pomembne razlike.ledvicadiabetičnih podgan. Vendar pa natančni mehanizmi za zaščitni učinek tropisetrona pri DN še niso znani. Kolikor nam je znano, je to prva študija, ki je pokazala, da je tropisetron povečal ekspresijo gena SIRT1 in zmanjšal razmerja fosforiliranih beljakovin FOXO3a/skupnega proteina FOXO3a, ravni NF-κB in beljakovin claudin- 1 vledvicaživali s sladkorno boleznijo.

SIRT1 je proteinska deacetilaza razreda III, ki se vključi v preživetje celic v stresnih razmerah z aktiviranjem več ključnih proteinov. Je bistven dejavnik za modulacijo genske ekspresije kot odgovor na nastajanje ROS, kot so transkripcijski faktorji NF-κB in foxo (Brunet et al. 2004; Sengupta et al. 2011). V družini foxo se domneva, da ima FOXO3a pomembno vlogo med oksidativnim stresom z uravnavanjem več antioksidantov, vključno s SOD in CAT

(Hasegawa et al. 2008; Kops et al. 2002). Zlasti je bila inaktivacija FOXO3a povezana z znižanjem oksidativnega stresa, ki ga povzroči CAT, med hiperglikemijskimi stanji (Wang et al. 2017b). SIRT1 upravlja aktivacijo FOXO3a z deacetilacijo in neposredno ali posredno modulira celični odziv na oksidativni stres (Hori et al. 2013). Izjavljeno je bilo, da obstaja funkcionalna povezava med regulacijo SIRT1 in FOXO3 antioksidativnega obrambnega sistema, ki ga posreduje MnSOD (Tanaka et al. 2009; Zhang et al. 2015). V skladu s tem Zhang et al. (2015) je dokazal, da je ikariin zaščitil akutno pljučno poškodbo, ki jo povzroča signalna pot SIRT1/FOXO3, posredovana z intestinalno ishemijo/reperfuzijo, s povečano regulacijo izražanja MnSOD. Prejšnja poročila so tudi namigovala, da uravnavanje SIRT1 ublaži nefropatijo, ki jo povzroča cisplatin,ledvičnaishemična/reperfuzijska poškodba in diabetična nefropatija (Funk in Schnellmann 2013; Gu et al. 2016; Kim et al. 2011). Predvsem znižana regulacija SIRT1, ki jo povzroči sladkorna bolezen, ki poganja patofiziološke spremembe, vodi doledvičnatoksičnost (Wang et al. 2017b). Hasegawa idr. (2013) so dokazali, da je zmanjšan SIRT1 v proksimalnih tubulih sprožil začetek DN in povzročil albuminurijo. S tem so se rezultati te raziskave identificirali zmanjšaliledvičnaEkspresija gena SIRT1 v skupini diabetikov. Zato je aktivacija SIRT1 povzročila odpornost naledvičnatubularne celice na celični stres (Kume et al. 2013). Skratka, aktivatorji SIRT1 so pridobili izjemno pozornost kot zanimivi kandidati za zdravljenje sladkorne bolezni (Song et al. 2018)

Poleg tega je ta raziskava pokazala tudi izrazit vnetni odziv pri sladkorni bolezniledvicekar dokazuje zvišanje NF-κB. Je bistveni regulacijski dejavnik, povezan z imunskim odzivom in vnetjem (Hayden in Ghosh 2012). V skladu z ugotovitvami te raziskave je več študij poročalo, da se aktivacija NF-κB in njegova jedrska translokacija povečata tako v eksperimentalni kot v človeški DN (Alzahrani et al. 2020; Kuhad in Chopra 2009). Poleg tega zvišanje SIRT1 prispeva k inaktivaciji NF-κB za reševanje podocitov pred poškodbami pri diabetikihledvica(Liu et al. 2014). Zanimivo je, da prekomerna ekspresija SIRT1 oslabi ekspresijo beljakovin v tesnih epitelijskih stikih, in sicer claudin-1, pri hiperglikemičnih podganah, kar je v korelaciji s stopnjo proteinurije. Aktiviran klavdin-1 v podocitih poslabša funkcijo glomerularne pregrade z zmanjšanjem izražanja sinaptopodina ali podocina, kar povzroči albuminurijo (Hasegawa et al. 2013). Te ugotovitve so potrdili tudi na ledvicah diabetičnih podgan.

Tu je bilo prvič dokazano, da je v diabetičnih stanjih dajanje tropisetrona povzročilo povečano ekspresijo gena SIRT1 in sočasno zmanjšalo razmerja fosforiliranega FOXO3a/celotnega proteina FOXO3a, ravni NF-κB in klaudin-1 proteina. Zato je zelo logično, da sta takšna aktivacija v SIRT1 in posledično zmanjšanje razmerij med fosforiliranim FOXO3a/celotnim proteinom FOXO3a, NF-κB in claudinom-1 delno odgovorna za izboljšanje diabetikdelovanje ledvic. Raziskovalci so poročali, da se zdi, da so zaščitni učinki tropisetrona pri DN 5-neodvisni od receptorjev HT3, saj granisetron, drugi selektivni zaviralec receptorjev 5-HT3, ni zaščitil DN. Izjavljeno je bilo, da imajo lahko antioksidativni in protivnetni mehanizmi tropisetrona ključno vlogo priledvičnega tkivazaščita pri sladkorni bolezni (Barzegar-Fallah et al. 2015). Pred kratkim je naš laboratorij ugotovil, da je zdravljenje s tropisetronom povečalo izločanje insulina in znižalo raven glukoze v krvi s povečanjem ekspresije gena GLUT2 kot tudi poti UCP2/ZnT8 (Naderi et al. 2020). Tropisetron kot zaviralec 5-receptorja HT3 je povečal sproščanje insulina iz linije beta celic trebušne slinavke, ki proizvaja insulin, kar je povzročilo hipoglikemijo (Heimes et al. 2009). Zato se zdi, da lahko moduliranje sproščanja insulina in posledično homeostaze glukoze vključuje antioksidativne in protivnetne odzive, ki prispevajo kledvicazaščita.

V skladu s sedanjimi ugotovitvami je tropisetron obrnil oksidativno škodo s povečanjem ekspresije gena SIRT1 pri staranju pri miših (Mirshafa et al. 2020). Poleg tega so po sočasnem zdravljenju s tropisetronom v jetrih podgan s sladkorno boleznijo opazili oslabitev poškodbe jeter, ravni beljakovin TNF- in IL{3}} (Amini et al. 2020; Gholizadeh-Ghaleh Aziz et al. 2019). Tudi v tej raziskavi je tropisetron pokazal podoben odziv kot standardno zdravilo, glibenklamid. Skladno s tem je izpostavljenost glibenklamidu povečala SIRT1 in zmanjšala razmerja med fosforiliranim FOXO3a/celotnim proteinom FOXO3a, ravni NF-κB in klaudina-1 pri sladkornih bolnikihledvicev trenutni študiji. Glibenklamid je uveljavljeno zdravilo, ki se pogosto uporablja pri zdravljenju bolnikov s sladkorno boleznijo z zaviranjem na ATP občutljivih kanalov K plus. Ker je bilo nekaj protislovnih rezultatov glede učinka glibenklamida pri DN (Akbar et al. 2013; Elmalí et al. 2004; Nakamura et al. 2000), verjetno zaradi odmerka ali trajanja zdravljenja, je ta dogodek spodbudil uvedbo novo zdravilo za sladkorne bolnike kot varno in učinkovito sredstvo z manj stranskimi učinki

Na splošno tropisetron učinkovito izboljšadelovanje ledvicv DN verjetno s spreminjanjem izražanja SIRT1, razmerij fosforiliranega FOXO3a/skupnega proteina FOXO3a, NF-κB in claudina-1. Ta študija je imela nekaj omejitev pri podpiranju te teme. Na primer, morfološke študije bi morale poskušati zagotoviti dodatne dokaze za potrditev sedanje preiskave. Prav tako raziskovalci niso uporabili molekularnih inhibitorjev, da bi potrdili natančen mehanizem signalne poti.

Zaključek

Za zaključek so ugotovitve te študije pokazale nefroprotektivni učinek tropisetrona pri T1DM, ki ga povzroči STZ. Pomembne ugotovitve te preiskave so pokazale, da je tropisetronov nefroprotektivni učinek verjetno vključeval spremembe v izražanju SIRT1, FOXO3a, NF-κB in claudina-1. Ti podatki so lahko spodbudni za nadaljnje raziskave na tem področju.