Učinkovitost prehranskih stranskih antioksidantov na inducirano ekspresijo genov CYP in histološke spremembe pri jetrih in ledvicah pujskov, hranjenih z aflatoksinom B1 in ohratoksinom A

edmund.chen@wecistanche.com

Povzetek:Namen te študije je bil raziskati potencial mešanice stranskih produktov, pridobljenih iz industrije olja grozdnih pešk in rakitovca, za ublažitev škodljive škode, ki jo povzročata ohratoksin A in aflatoksin B1 na jetrih inledvičnapri pujskih po odstavitvi. Štirideset križanih hibridnih pujskov TOPIGS-40 po odstavitvi je bilo razvrščenih v tri poskusne skupine (E1, E2, E3) in eno kontrolno skupino (C) ter jih 30 dni hranili s poskusnimi dietami. Bazalna prehrana je služila kot kontrola in je vsebovala običajno krmno mešanico za začetnike pujskov brez mikotoksinov. Poskusne skupine so bile hranjene na naslednji način: E1 - bazalna prehrana plus mešanica (1:1) dveh stranskih produktov (moka iz grozdnih pečk in rakitovca); E2—bazalna prehrana, eksperimentalno kontaminirana z mikotoksini (479 ppb OTA in 62 ppb AFB1); in E3—bazalna dieta, ki vsebuje 5 odstotkov mešanice (1:1) moke iz grozdnih pečk in rakitovca in je kontaminirana z mešanico OTA in AFB1. Po 4 tednih so živali zaklali in vzeli vzorce tkiva iz jeter in ledvica za izvedbo genske ekspresije in histološke analize. Analiza izražanja genov je pokazala, da je bilo izražanje večine analiziranih genov zmanjšano, ko so bili odstavljeni pujski hranjeni s kontaminirano hrano. V družini CYP450 je bil CYP1A2 gen z najvišjo znižano regulacijo. Glede na te rezultate smo v jetrih ugotovili, da mikotoksini povzročajo histomorfološke spremembe v jetrih inledvicain je vplival na stopnjo ekspresije CYP1A2, CYP2A19, CYP2E1 in CYP3A29, vendar nismo zaznali pomembnih sprememb v ravni ekspresije genov CY4A24, MRP2 in GSTA1.

Ključne besede: pujski; antioksidativni učinek; krmni dodatki; mikotoksini; izražanje genov CYP; ledvice; ledvična

Uvod

Mikotoksini so sekundarni toksični metaboliti, ki jih proizvajajo določeni sevi nitastih gliv. Te spojine z nizko molekulsko maso (do 500 Da) lahko kontaminirajo različne surovine in povzročijo povečano tveganje za zdravje ljudi in živali [1]. Število mikotoksinov, opisanih in z dobro znanimi učinki, je relativno majhno zaradi množice metabolitov s toksičnim potencialom, ki jih ustvarjajo glive [2-4]. Razvrščeni so v pet skupin s specifično kemijsko strukturo, ki se pogosto pojavljajo v krmi in hrani: trihoteceni, zearalenon, okratoksini, fumonizini in aflatoksini. Glive, ki proizvajajo mikotoksine in jih najdemo v hrani in krmi, so razdeljene v dve skupini: tiste, ki vdrejo pred žetvijo žita, imenovane poljske glive, in tiste, ki rastejo šele po žetvi, imenovane skladiščne glive [5]. Na evropski ravni obstajajo predpisi in priporočila glede najvišje dovoljene ravni za šest vrst mikotoksinov, ki jih običajno najdemo v krmi za prašiče: aflatoksine, fumonizine, okratoksine, deoksinivalenol, toksin T2 in zearalenon [6 – 8]. Med vrstami rejnih živali so prašiči zelo občutljivi na mikotoksine zaradi izpostavljenosti krmi na osnovi žit [9]. Presnova prašičev ni učinkovita pri razstrupljanju in izločanju mikotoksinov, kar povečuje tveganje za mikotoksikozo. Ta občutljivost se spreminja tudi glede na starost, koncentracijo mikotoksinov v krmi in trajanje izpostavljenosti. Jetra so organ, ki ga zaužitje teh toksinov najbolj prizadene [10]. Poleg tega ti toksini povečajo prepustnost črevesne epitelijske pregrade pri prašičih in perutnini, kar lahko povzroči nagnjenost k nekrotičnemu enteritisu [11] in zmanjšanju prirojene imunosti.

CISTANCHE BO IZBOLJŠAL DELOVANJE LEDVIC/LEDVIC

Aflatoksini so najpogostejši mikotoksini, ki jih najdemo v živilih, oljnicah, žitih, mleku, zemlji, živalih in ljudeh. Vse vrste aflatoksinov izvirajo iz vrst gliv, ki pripadajo rodu Aspergillus, in veljajo za najbolj škodljive mikotoksine za živali in ljudi [4, 10 – 17]. Kot je navedeno zgoraj, so glavni biološki učinki aflatoksinov pri sesnih pujskovih in prašičih v odraščanju, končnih in plemenskih prašičih rakotvornost, imunosupresija, mutagenost, teratogenost, zmanjšana krmna učinkovitost in slabo pridobivanje teže, okvara jeter in spremenjeni biokemični parametri seruma [18, 19]. . Hudi učinki pri prašičih lahko povzročijo akutni hepatitis, sistemske krvavitve, nefrozo in smrt [20] ter zmanjšano odpornost na stres [21]. Nekateri avtorji so tudi pokazali, da so prašiči, hranjeni z nizko vsebnostjo aflatoksinov, pokazali znake pljučnega edema, zmanjšano porabo krme in povečanje telesne mase ter zmanjšanje encimskih aktivnosti, ki so vpletene v oksidativno dekarboksilacijo, kot tudi celotne serumske beljakovine, krvni tlak in skupno število levkocitov [18, 22-24]. V tem kontekstu je v skladu z Direktivo Evropske komisije 2003/100/ES najvišja dovoljena raven aflatoksina B1 (AFB1) za prašiče določena na 0,02 mg/kg. Ohratoksini so sekundarni metaboliti, ki jih proizvajajo vrste gliv iz rodu Aspergillus in Penicillium. Objavljena so bila različna mnenja glede genotoksičnih ali negenotoksičnih mehanizmov toksičnosti okratoksinov [25, 26]. Študije in vitro in in vivo so pokazale, da so adukti DNK, specifični za gvanin-OTA, vztrajali več kot 16 dni priledvičnaravni, medtem ko so jih v jetrih in vranici odstranili po 5 dneh [27]. Zaradi tega so bili njihovi glavni toksični in rakotvorni učinki izraženi vledvica[28].

Večina metabolitov okratoksinov iz I. in II. faze razstrupljanja je nizko toksičnih. V želodcu se del okratoksinov hidrolizira v okratoksin s proteolitičnimi encimi. Druga možnost za njihovo hidrolizo je odprtje laktonskega obroča v alkalnih pogojih črevesja, kar povzroči spojino z visoko toksičnostjo. Zaradi močne vezave na albumin je izločanje okratoksinov z glomerulno filtracijo zanemarljivo, izločanje pa poteka predvsem s tubularno sekrecijo. Tubularna resorpcija velja za delno odgovorno za intracelularno kopičenje okratoksinov [29, 30]. Na splošno se pri domačih živalih okratoksini po zaužitju hitro absorbirajo skozi gastrointestinalni trakt (želodec in proksimalni del jejunuma) na pasiven način, čemur daje prednost visoka afiniteta vezave okratoksinov na plazemske beljakovine, in v neionizirani obliki. , kar pojasnjuje njihovo obstojnost v telesu. V prašičjem serumu se ohratoksini bolj specifično vežejo na beljakovine z molekulsko maso manjšo od 20 kDa, kar jim omogoči prehod skozi glomerularno bazalno membrano in povzroči nefrotoksične učinke. Ohratoksini se kopičijo tudi v jetrih in mišicah. vendarledviceso glavno mesto shranjevanja okratoksinov, njihova reabsorpcija v proksimalnih in distalnih tubulih pa prispeva k obstojnosti telesa in povečani nefrotoksičnosti [27,31]. Po drugi strani pa, ko se AFB1 absorbira na črevesni ravni, doseže jetra, kjer ga transformirajo presnovni encimi faze I s hidroksilacijo, hidracijo, demetilacijo in epoksidacijo. Prve tri reakcije ustvarjajo netoksične metabolite, medtem ko četrta proizvaja AFB1-8,9 epoksid, ki tvori adukte z DNA na mestu N7 gvanina [32]. Prav tako se lahko AFB1 konjugira z reduciranim glutationom v reakciji, ki jo katalizirata glutation-S-transferaze [33] in glukuronska kislina [34]. Izločanje AFB1 poteka predvsem skozi žolčne poti, ki jim sledi urinska pot [35].

Ena od glavnih težav pri nadzoru mikotoksinov je, da je v seriji krme ali žit hkrati prisotna več kot ena vrsta mikotoksina. Tako lahko krmljenje pujskov in prašičev s kontaminirano krmo z več vrstami mikotoksinov, tudi če so le-ti v minimalnih koncentracijah, zaradi sinergističnega učinka povzroči številne negativne posledice [36 – 40]. V tem kontekstu bi zmanjšanje in odprava negativnih učinkov mikotoksinov, ki jih najdemo v krmi za prašiče, lahko zmanjšala proizvodne stroške in izgube v industriji prašičev. Do danes so bile razvite številne strategije za preprečevanje, zmanjšanje ali celo odpravo kontaminacije z mikotoksini iz živalske krme z biološkimi, kemičnimi in fizikalnimi metodami razstrupljanja. Te metode omogočajo razgradnjo mikotoksinov in njihovih ustreznih metabolitov ter ohranjajo hranilno vrednost hrane brez vnosa drugih snovi s toksičnim potencialom v biološke sisteme [6,14,41]. Dobra rešitev je biološka dekontaminacija mikotoksinov s kompetitivno inhibicijo z drugimi sevi gliv ali dodajanje antioksidantnih spojin v živalsko krmo, da bi zmanjšali toksične učinke mikotoksinov in/ali zavirali rast vrst gliv, ki proizvajajo mikotoksine. Najpogosteje uporabljena metoda za preprečevanje negativnega vpliva mikotoksinov na domače živali je dodajanje "veznikov mikotoksinov" ali "modifikatorjev mikotoksinov", ki so aluminosilikati s porozno strukturo, ki lahko adsorbirajo in ujamejo mikotoksine [42–44]. So zelo učinkoviti za aflatoksine in imajo omejeno aktivnost proti drugim vrstam mikotoksinov. Ker pa so nespecifični, vežejo tudi vitamine in elemente v sledovih, kar povzroča pomanjkanje [45–47]. Dodajanje nekaterih rastlinskih antioksidantov v krmo bi lahko bila boljša rešitev [48] za zmanjšanje škodljivih učinkov mikotoksinov na zdravje živali.

encimi citokromov P450, ki so večinoma prisotni v jetrih, prebavnem traktu inledvica,igrajo pomembno vlogo v fazi I biotransformacije ksenobiotikov, zlasti tistih, ki pripadajo družini 1 in 3 [49]. Mikotoksini so lahko substrati, zaviralci ali induktorji teh presnovnih encimov. Spremembe v specifični aktivnosti in inducibilnosti citokroma P450 bodo na koncu določile relativno spremembo presnove ksenobiotika. Mikotoksini lahko spremenijo gensko izražanje teh proteinov, kar povzroči spremenjeno absorpcijo in biotransformacijo hranil in drugih substratnih zdravil iz krme. Zaradi tega je bil cilj te študije raziskati potencial mešanice stranskih produktov, pridobljenih iz industrije olja Vitis vinifera (grozdne pečke) in Hippophae rhamnoides (rakitovec), za ublažitev škodljive škode, ki jo povzroči sočasna prisotnost ohratoksina A (OTA) in aflatoksin B1 (AFB1) v krmi pri jetrih inledvičnapri pujskih po odstavitvi.

Rezultati

Sestava dieteKemična sestava moke stranskih produktov je pokazala, da je rakitovčeva moka bogatejša z beljakovinami (plus 38,4 odstotka), maščobami (plus 66,6 odstotka) in ogljikovimi hidrati ter nižja vsebnost pepela kot moka grozdnih pešk (tabela 1).

Kemijska analiza je pokazala tudi drugačen profil obeh stranskih produktov v maščobnih kislinah, flavonoidih, fenolnih kislinah in mineralih. Tako ima rakitovčeva moka višjo vsebnost nasičenih maščobnih kislin (palmitinska in palmitoleinska), omega-9 kislin (cis oleinska kislina) in omega-3 kisline (-linolenska kislina) kot moka grozdnih pešk. . Nasprotno pa ima moka grozdnih pešk zelo visoko vsebnost omega-6 kislin (linolne kisline) (67,35 odstotka v primerjavi z 18,59 odstotka v moki rakitovca) (tabela 2).

Oba stranska produkta vsebujeta flavonoide in fenolne kisline, bioaktivne spojine, znane po svojih antioksidativnih, protivnetnih in imunomodulatornih lastnostih [50, 51]. Tako je bila skupna koncentracija polifenolov za 74,8 odstotka večja v moki grozdnih pečk (133,84 mg GAE/L) kot v rakitovcu (76,57 mg GAE/L). Kar zadeva različne razrede polifenolov, vsebuje moka grozdnih pešk višjo koncentracijo katehina in vanilijeve kisline kot rakitovca, medtem ko je rakitovca bogatejša z rutinom, kvercitrinom, luteolinom, p-kumarinsko kislino in ferulinsko kislino (tabela 3). Glede na mineralno sestavo ima rakitovčeva moka višjo vsebnost K, Mg, Fe, Mn in Zn kot moka grozdnih pečk. Nasprotno pa je moka grozdnih pečk vsebovala dvakrat več bakra kot moka rakitovca. Omeniti velja visoko koncentracijo železa iz moke rakitovca (tabela 4).

Animal Performance

Izpostavljenost pujskov iz skupine E2 mešanici okratoksina in aflatoksina B1 ni imela škodljivih učinkov na telesno maso, prirast in zaužitje krme, saj razlike v primerjavi s kontrolo niso bile značilne. Nasprotno pa je dajanje hrane, ki je vsebovala samo mešanico stranskih produktov (E1), znatno povečalo telesno težo pujskov, ki so jih hranili s to dieto, v primerjavi s kontrolo (32,14 ± 1,63 proti 27,09 ± 1,31) in skupino E2, ki je bila hranjena s kontaminirano hrano. prehrana (32,14 ± 1,63 v primerjavi z 28,72 ± 1,07). Opozoriti je treba, da je skupina pujskov, ki so prejemali kontaminirano krmo in mešanico stranskih produktov, imela tendenco pridobivanja teže v primerjavi s skupino pujskov zastrupljenih z mikotoksini, čeprav razlika ni bila pomembna. Analiza biokemijskih parametrov, ki označujejo splošno zdravstveno stanje živali in delovanje jeter inledvice, registrirane normalne vrednosti za starostno in težno kategorijo odstavljenih pujskov. Pri večini niso bile ugotovljene pomembne razlike med skupinami (tabela 5). Vendar je mešanica mikotoksinov povečala aktivnost ALP in gama GT v primerjavi s kontrolo in zmanjšala aktivnost v kontrolni ravni v skupini E3, ki je prejemala mešanico stranskih produktov.

Histologija jeter in ledvicSvetlobna mikroskopska analiza jeter iz skupine E2, hranjenih z bazalno prehrano, kontaminirano z mešanico OTA in AFB1, je pokazala žariščna področja nekroze, dilatacijo sinusoida in vnetno parenhimsko infiltracijo. Portalna področja so pokazala mononuklearno celično infiltracijo in periportalno fibrozo. Opazili so tudi fibrotične perilobularne fibrotične septume (slika 1)

Uporaba mikotoksina je povzročila strukturne spremembe vledviceki prizadene tako skorjo kot medulo. Opazili smo atrofijo glomerulnih šopov in spremembo Bowmannove kapsule (Slika 2). Tubuli so pokazali nekrozo obloge epitelijskih celic z infiltracijo vnetnih celic vmes. Žariščne agregate vnetnih celic so opazili med glomeruli in tubuli v povezavi z žariščnimi območji zastojev v krvnih žilah, zlasti v medularni regiji. Očitno so proliferacijo kolagena opazili predvsem na območjih tubularne poškodbe. Poleg tegaledvicaodseki iz skupin E3, skupina, hranjena z bazalno dieto, ki je vsebovala mešanico grozdnih pečk in moke iz rakitovca ter kontaminirana z mešanico OTA in AFB1, je pokazala manjše patomorfološke spremembe, skoraj podobne kontroli.

V jetrih se je izražanje gena za CYP1A2 zmanjšalo za 18 odstotkov za E2 oziroma 44 odstotkov za E3 v primerjavi s skupino E1. Ekspresija gena CYP2A19 je bila v skupinah E1 in E2 nespremenjena, v skupini E3 pa se je zmanjšala za skoraj 62 odstotkov. V skupini E1, hranjeni z bazalno prehrano, dopolnjeno z mešanico grozdnih pešk in moke iz rakitovca, so opazili znatno povečanje za 29 odstotkov v izražanju gena CYP2E1 v primerjavi s skupino E2. Nasprotno pa je dajanje bazalne prehrane, obogatene z mešanico grozdnih pečk in moke iz rakitovca (skupina E1), zmanjšalo izražanje gena CYP3A29 za 24 odstotkov v primerjavi z ravnijo skupine E2. Drugo nasprotje so opazili pri ekspresiji gena CYP4A24, s 33-odstotnim zmanjšanjem za skupino E1 in 24-odstotnim zmanjšanjem za skupino E3 ter pomembnim 41-odstotnim povečanjem v skupini E2, hranjeni z bazalno prehrano, dopolnjeno z mešanico AFB1 in OTA v primerjavi z kontrolno ravnjo. V primeru MRP2 je bil vzorec genske ekspresije podoben kot pri genu CYP4A24, z nepomembnim 35-odstotnim zmanjšanjem za skupino E1 in 24-odstotnim zmanjšanjem za skupino E3 ter pomembnim 28-odstotnim povečanjem v skupini E2 v primerjavi z na nadzorni nivo. Podobno kot pri ekspresiji gena CYP4A24 je ekspresija gena GSTA1 pokazala znatno 14-odstotno povečanje v skupini E2, 9-odstotno povečanje v skupini E1 in 30-odstotno zmanjšanje v skupini E3. Očitno je sočasno dajanje mešanice grozdnih pečk in moke rakitovca ter OTA in AFB1 povzročilo zmanjšanje izražanja vseh analiziranih genov v jetrih v primerjavi s kontrolo. Glede stopnje izražanja teh genov vledvice,v primerjavi z jetrnimi vzorci niso opazili statistično pomembnih sprememb (slika 4). Vendar pa je mogoče opaziti spremembe v regulaciji ravni izražanja genov.

Če analiziramo sliko 4, lahko opazimo, da je mešanica grozdnih pešk in moke iz rakitovca znižala ekspresijo gena CYP1A2 in povečala ekspresijo genov CYP2A19, CYP2E1, CYP3A29 in CYP4A24 na nepomemben način, medtem ko je ekspresija genov MRP2 in GSTA1 ostala nespremenjena . Prav tako je prisotnost OTA in AFB1 pri krmi pujskov zmanjšala ekspresijo genov CYP1A2 in CYP2A19 na nepomemben način, medtem ko sta bila MRP2 in GSTA1 nespremenjena. Sočasno dajanje mešanice grozdnih pečk in moke iz rakitovca ter OTA in AFB1 je določilo vrnitev ravni izražanja vseh genov na kontrolne ravni z izjemo GSTA1, ki je predstavljal pomembno povečanje v primerjavi s skupino E1.

Diskusija

Mikotoksini, kot sta AFB1 in OTA, so naravni toksini, ki onesnažujejo veliko različnih rastlinskih proizvodov. Posledično so AFB1, OTA in njihovi metaboliti prisotni v živilih in krmi ter v izdelkih živalskega izvora [52]. Večina toksikoloških študij o učinkih mikotoksinov je obravnavala izpostavljenost eni sami vrsti mikotoksinov, ne da bi upoštevala kombinacijo oziroma interakcijo med njimi, sinergistične ali antagonistične učinke, ki se pogosto pojavljajo v naravi. Podatki o toksičnih učinkih kombinacij mikotoksinov so omejeni, zato tveganja izpostavljenosti več vrstam toksinov še niso znana. Pojavnost mikotoksinov, kot so AFB1, DON, ZEA, OTA, FB1 in FB2 v žitu, žitnih izdelkih ter dopolnilnih in popolnih krmnih mešanicah za prašiče [ 16 ] je povezana z geografsko lego in podnebnimi spremembami, ki povečujejo tveganje, povezano z s kontaminacijo mikotoksinov med skladiščenjem in predelavo krmnih proizvodov za prašiče [53]. Sokontaminacija žit in drugih surovin se v resničnem življenju pojavlja pogosteje kot posamezna kontaminacija z mikotoksini [7]. Na primer, sočasno pojavljanje aflatoksina B1 in ohratoksina A je bilo ugotovljeno v različnih živilih ali sestavinah krme, kot so pšenica [54], ječmen [55], žitna moka [56], začimbe [57] itd. med AFB1 in OTA v krmi je bilo ugotovljeno, da je približno 1 do 6 [37]. Tudi globalna krmna vsebnost v AFB1 in OTA se je gibala med nedoločeno in 100 ppb oziroma nedoločeno in 211 ppb [58]. V tem kontekstu smo z namenom posnemanja pogojev na terenu preučevali učinke teh mikotoksinov skupaj in ocenili učinkovitost mešanice stranskih proizvodov pri preprečevanju učinkov mikotoksinov. Naravni dodatki (grozdna pečka in stranski proizvodi rakitovca) so bili izbrani glede na njihovo sposobnost lajšanja mikotoksikoze po prehranskih dopolnilih [59,60].

V tej študiji izpostavljenost pujskov (skupina E2) mešanici mikotoksinov ni vplivala na učinkovitost živali (27,83 ± 1,1 proti 27.09 ± 1,3 za telesno težo in 1,48 ± 0 .9 proti 1,40 ± 0.8 za vnos krme) in biokemičnih parametrov v primerjavi s kontrolo. Podobno Balogh et al. [61] so poročali, da pujski, krmljeni s približno 0,4 mg/kg OTA v začetni fazi (0–28 dni) in obdobju gojenja (29–49 dni), niso zabeležili pomembnih sprememb proizvodnih lastnosti in kliničnih znakov toksičnosti pri gojitelju. faza. Nasprotno pa so v začetnem obdobju, ko so bile živali bolj občutljive, opazili znatno zmanjšanje povečanja telesne teže. V tej študiji je vključitev samo mešanice stranskih proizvodov v prehrano pomembno vplivala na zmogljivost živali (skupina E1) in je povečevala težo pujskov, ko je bila mešanica povezana s kontaminirano hrano (skupina E3).

S toksikološkega vidika je IARC (Mednarodna agencija za raziskave raka) OTA uvrščen v isto skupino (2B) rakotvornih snovi za ljudi, ki ima podobno toksičnost kot AFB1 [62]. Toksikokinetični vzorci absorpcije, porazdelitve in izločanja teh mikotoksinov so večinoma povsem pojasnjeni. Nasprotno pa kljub nedavnemu napredku naše znanje o korakih toksikokinetične biotransformacije ni podrobno pojasnjeno. Številne študije so pokazale, da AFB1 in OTA presnavljajo jetrni mikrosomi ljudi, prašičev in podgan v več epimerov [63]. Spremembe specifične aktivnosti in inducibilnosti citokroma P450 na koncu določajo relativno spremembo presnove katerega koli ksenobiotika.

Ugotovljeno je bilo, da je izpostavljenost AFB1 in OTA zmanjšala izražanje genov CYP1A2, CYP2E1, CYP3A29 in MRP2 v prašičjih jetrih in povzročila več sprememb v histologiji in ultrastrukturi jeter, vključno z žariščnimi območji nekroze, dilatacijo sinusoida, vnetnim parenhimom. infiltracijo in periportalno fibrozo. Glede ravni genske ekspresije izoform CYP450 pri prašičihledvica,v znanstveni literaturi ni bilo na voljo nobenih podatkov. Geni CYP1A2, CYP2A19, CYP2E1, CYP3A29, CYP4A24, MRP2 in GSTA1 so bili izbrani za to študijo, ker kodirajo proteine ​​z encimsko aktivnostjo ali transportno funkcijo, ki so vključeni v fazo I in fazo II biotransformacije in razstrupljanja ksenobiotikov za tvorbo elektrofilno reaktivnih metaboliti [64]. Glede na te rezultate se zdi, da je dajanje stranskega proizvoda povzročilo zmanjšanje izražanja gena CYP1A2 in povečanje izražanja gena GSTA1. Podobne rezultate so opazili pri HT-29 človeških rakavih celicah debelega črevesa, zdravljenih z izvlečkom Salicornia freitagii, znanim po svojem antioksidativnem in protivnetnem delovanju. V tem primeru je zaradi vsebnosti bioaktivnih fenolov prišlo do znižanja mRNA CYP1A2 in povečanja mRNA GSTA1 [65]. V nasprotju z našimi rezultati je bila ekspresija mRNA in beljakovin CYP1A2 povečana v jetrih prašičev, hranjenih s cikorijo [66]. Te različne rezultate so verjetno povzročile različne naravne spojine v cikoriji v primerjavi s stranskimi produkti, uporabljenimi v tej študiji, predvsem klorogensko, kofeinsko in p-kumarinsko kislino [67].

Po drugi strani pa sta OTA in AFB1 verjetno sodelovala z in aktivirala aromatski ogljikovodikov receptor, kar je vodilo do njegove jedrske translokacije. Po heterodimerizaciji sta OTA in AFB1 verjetno vplivala na jedrski translokator ogljikovodikovega receptorja, heterodimer, vezan na ksenobiotične odzivne elemente in transaktivirane gene, kot so CYP1A1, CYP1A2 in GST [68]. Ta element, ki se odziva na ksenobiotike, si delita gena CYP1A1 in CYP1A2 [69], oba encima, ki ju kodirata, pa predstavljata prekrivajočo se substratno specifičnost [70]. V prašičjih jetrih je prisotna le aktivnost CYP1A2, njegova relativna količina skupnega odkritega CYP450 pa je 4 odstotke [71]. V človeških jetrih sta AFB1 in OTA induktorja za CYP1A1, 1A2, 2B6, 2C9, 3A4 in 3A5 [72]. AFB1 in izpostavljenost OTA povzročata mitohondrijsko disfunkcijo, za katero je značilno povečanje proizvodnje ROS [14], ki lahko poveča izražanje TGF- 1 ali aktivira latentni TGF- 1 [73]. Ob upoštevanju prejšnjih dokazov, da je TGF- 1 zmanjšal ekspresijo CYP1 pri ljudeh in podganah, je možno, da se je isti mehanizem [74] pojavil v naših pogojih. Učinki sočasne izpostavljenosti tako mikotoksinom kot stranskim produktom grozdnih pečk in rakitovca so bili verjetno sinergistični, izražanje CYP1A2 pa je bilo manjše pri E3 v primerjavi z E1, E2 in kontrolno skupino. CYP1A2 se izraža v nižjih ravneh v ekstrahepatičnih tkivih [75].

CISTANCHE BO IZBOLJŠAL LEDVIČNO/LEDVIČNO OKVARJO

Theledvicaje organ, ki prejme približno 25 odstotkov srčnega utripa in očisti presnovne ostanke in ksenobiotike iz obtočil. Med tem postopkom praznjenja se strupene snovi koncentrirajo vledvica[76]. V pujskiledvice, je bila variacija ekspresije gena CYP1A2 podobna ravni ekspresije v jetrih za E1 in E2. Zanimivo je, da je bila v skupini E3 izraženost tega gena na višji ravni kot v kontrolni skupini. To bi lahko bilo posledica aktivacije nekanonične signalne poti za transkripcijo AhR vledvicacelice [77]. V prašičjih jetrih predstavljata relativni količini CYP2A19 in CYP2E1 31 odstotkov oziroma 13 odstotkov celotnega CYP450 [71]. Geni CYP2A19 in CYP2E1 prašičev so odgovorni za biotransformacijo endogenih spojin (skatol, spolni hormoni) kot tudi eksogenih spojin (komponente hrane). Obe vrsti spojin sta močno izraženi v jetrih in manj vledvicain maščobnega tkiva. Transkripcijo CYP2A19 nadzira transkripcijski faktor CAR [78]. Njegov človeški ortolog CYP2A6 nadzirajo CAR, PXR, glukokortikoidni receptor (GR), estrogenski receptor, HNF 4 in PGC-1 [79]. Poleg tega konstitutivno jetrno izražanje CYP2A6 pri miših ureja medsebojno delovanje med HNF 4, vezavnim proteinom CCAAT-box/enhancer (C/EBP, C/EBP) in oktamernim transkripcijskim faktorjem-1 (okt{{13} }) [ 80 ]. Prej so opazili pozitivno korelacijo med nivoji mRNA in beljakovin za gen CYP2A19 [81]. Za razliko od drugih genov CYP 450 ima CYP2A19 manj pomembno vlogo pri presnovi ksenobiotikov, vendar je vključen v reakcijo celic na stres, Nrf-2, pri čemer je vključen tudi v transkripcijo CYP2A19 [82]. Gen CYP2A19 je verjetno zelo polimorfen v primerjavi z genom CYP2A6 [83] in lahko pride do obsežne medindividualne variacije njegovega produkta. Prejšnje študije so pokazale, da sta ortologa račjega P450 CYP2A6 in CYP3A4 pri sesalcih vključena v bioaktivacijo AFB1 v njegovo epoksidno obliko [84]. Za razliko od teh rezultatov v tej študiji niso opazili pomembnih sprememb izražanja gena CYP2A19 v skupinah E1 in E2, verjetno zaradi visoke stopnje izražanja tega gena v jetrih pujskov. Za zdaj je težko razložiti, zakaj je sočasna izpostavljenost mikotoksinom in mešanici moke grozdnih pešk in rakitovca zmanjšala izražanje CYP2A19. Vendar je to zmanjšanje izražanja zmanjšalo tveganje za nastanek strupenih metabolitov.

Pri prašičuledvica,izražanje CYP2A19 je manjše v primerjavi s tistim v jetrih [79]. Verjetno zaradi tega manjšega izražanja je izpostavljenost živali mešanici grozdnih pečk in moke iz rakitovca povzročila uravnavanje ekspresije gena CYP2A19, ki jo povzroča Nrf-2, zaradi vsebnosti luteolina [85] in ferulinske kisline [86]. . Po drugi strani pa obstajajo dokazi, da sta samo dva transkripcijska faktorja, tj. transkripcijski faktor promotorja piščančjega ovalbumina (COUP-TF1) in jedrski faktor hepatocitov (HNF-1), vključena v regulacijo transkripcije CYP2E1 pri prašičih. [87]. CYP2E1 se tako kot drugi P450, ki presnavljajo ksenobiotike, v glavnem nahaja v membrani endoplazmatskega retikuluma (ER) in ga je mogoče inducirati pod različnimi presnovnimi ali prehranskimi pogoji. Stres ER lahko povzroči presnovni stres, ki ga povzroči preobremenitev biosinteze beljakovin/lipidov, in oksidativni stres, ki bi lahko sprožil evolucijsko ohranjeno kompleksno homeostatsko signalno pot, znano kot nerazvit proteinski odziv (UPR) [88].

Verjetno je bila raven mRNA CYP2E1 približno enaka v skupini E1 in kontrolni skupini zaradi antagonističnih učinkov palmitinske kisline [89], linolne in -linolenske kisline [90], ki so povečale transkripcijo tega gena in delovanja vanilije in p-kumarske kisline, ki so ga zmanjšale [65]. Nedavno je bilo dokazano, da je krma, ki vsebuje OTA, spremenila črevesno mikrobioto pri racah, kar je vplivalo na raznolikost in sestavo mikrobiote cekuma ter črevesno pregrado. Posledično so lipopolisaharidi, pridobljeni iz gramnegativnih bakterij, vstopili v kri in jetra, kar je povzročilo vnetje jeter [91]. V primeru imunsko pogojene poškodbe jeter je bila ekspresija CYP2E1 zmanjšana [92]. Ta situacija bi se lahko zgodila v skupini E2. Verjetno je, da so kumulativni učinki obeh mikotoksinov in prehranskih stranskih produktov zmanjšali izražanje CYP2E1 v jetrih skupine E3. Vledvica,proste maščobne kisline, kot so palmitat, oleat in linoleat, so shranjene v nefronu [93] in te kisline so verjetno povečale izražanje gena CYP2E1 vledviceskupine E1 v primerjavi s kontrolno ravnjo. Po Pfohl-Leszkowiczu in Mandervillu [25] OTA tvori adukt z DNA, kar ustvarjaledvičnagenotoksičnost in karcinogeneza. Verjetno so visoke ravni OTA stimulirale izražanje gena CYP2E1 vledviceskupine E2 v primerjavi s kontrolno ravnjo. V skupini E3 se zdi, da je imelo sočasno dajanje obeh mikotoksinov in prehranskih stranskih produktov antagonistične učinke, pri čemer se je izražanje gena CYP2E1 vrnilo na kontrolno raven. Poleg tega je histološka ocena za skupino E3 pokazala, da je mešanica stranskih produktov, pridobljena iz grozdnih pečk in olja rakitovca, ublažila škodljivo škodo, ki jo povzročita aflatoksin B1 in ohratoksin A na jetrih inledvičnapri pujskih po odstavitvi. CYP2E1 se tako kot drugi P450, ki presnavljajo ksenobiotike, v glavnem nahaja v membrani ER in se lahko inducira pod različnimi presnovnimi ali prehranskimi pogoji [89]. Regulacija gena CYP2E1 v skupini E1 je bila verjetno posledica hidroksilacije spojin, pridobljenih iz kumarina, ki so jo katalizirali encimi CYP2A, ki veljajo za specifične indikatorje prisotnosti encimov CYP2 [94], s p-kumaričnim kislina, ki je prisotna v stranskih proizvodih grozdnih pečk in rakitovca.

V primeru prašičev je zelo malo znanega o prisotnosti encimov CYP3As vledvično tkivo,in nič ni znanega o njihovi inducibilnosti [95]. V poddružini CYP3A sesalcev je bilo identificiranih več genov (na primer pet pri podganah in štirje pri ljudeh), vendar izražanje teh genov vledvična tkivaje bil slabo raziskan [96]. Kar zadeva izražanje genov, Ayed-Boussema et al. (2012) [63] in Gonzalez-Arias et al. [97] je opisal povečanje ravni izražanja v vseh testiranih citokromih (CYP3A4, 2B6, 3A5 in 2C9) v primarni kulturi človeških hepatocitov. Prejšnje študije so poročale o različnih rezultatih v zvezi z učinki AFB1 in OTA v primarno gojenih človeških hepatocitih, v katerih so naraščajoče koncentracije teh mikotoksinov jasno povzročile ravni mRNA CYP3A4 in CYP2B6 na način, ki je odvisen od odmerka [63]. Nasprotno pa je bilo ugotovljeno, da se je v prisotnosti OTA in AFB1 v jetrih (slika 3, skupina E2) raven ekspresije CYP3A29 zmanjšala v primerjavi s kontrolno ravnjo, morda zaradi aktivacije AhR [98]. Ti podatki se razlikujejo od podatkov Zepnika et al. [99], ki je poročal o povečanju hidrolize OTA z mikrosomskimi encimi iz podganjih jeter, posebej za P450 3A1/2 in 3A4, kar nakazuje, da je ta genska ekspresija modulirana na način, odvisen od vrste. V nekaterih primerih ima lahko zaviranje encimov P450 s polifenoli kemopreventivni učinek zaradi potencialne aktivacije rakotvornih snovi z encimi P450 med potekom njihove naravne presnovne aktivnosti. Inhibicija encimov faze I, ki presnavljajo ksenobiotike, bi lahko bila ena od tarč kemopreventivnih učinkov naravno prisotnih obročnih polifenolov. Povečanje CYP4A24, opaženo v jetrih, je lahko fiziološki odziv v nenavadnem kontekstu nenormalnega kopičenja lipidov in odsotnosti aktivnosti CYP2E1 zaradi dejstva, da sta CYP2E1 in CYP4A inducibilna jetrna mikrosomska citokroma P-450, vključena v hidroksilacijo maščobnih kisline in oba lahko sprožita avto-propagativni proces peroksidacije lipidov. Lahko se dopolnjujejo, kar vodi do interakcij pri regulaciji posameznih encimov [100]. Zato je jasno, da so proteini CYP4A ključni posredniki v prilagoditvenem odzivu na motnje presnove lipidov v jetrih [101]. Znižana raven CYP4A24 vledvicaverjetno vodi do toksičnih učinkov, ki nastanejo v jetrih zaradi prehrane, onesnažene z mikotoksini, kar pomeni, da CYP4A24 uravnava jetrni ER stres [102,103].

CISTANCHE BO IZBOLJŠAL LEDVIČNE/LEDVIČNE BOLEČINE

V tej študiji je dodatek mešanice stranskih produktov moke grozdnih pečk in rakitovca povečal stopnje izražanja vledvica,za katere bi pričakovali, da bodo favorizirali procese izločanja in vzdrževanje ravnovesja znotrajceličnih snovi [104]. Poleg tega se je OTA absorbiral v črevesju, kjer ima protein 2 odpornosti na več zdravil (gen MRP2) pomembno vlogo, ki deluje kot ksenobiotični zunanji prenašalec za zmanjšanje oralne biološke uporabnosti in obremenitve organov s toksini in s tem toksičnosti OTA. Ko OTA doseže krvni obtok, lahko doseže druge organe, kot so jetra, transporter MRP2 pa je spet ključni primarni aktivni transporter, ki je vključen v ekstruzijo anionskih konjugatov in ksenobiotikov v zunajcelični prostor, kar prispeva k tvorbi žolča in kasnejšemu izločanju toksina [ 97, 105]. Prav tako je transporter MRP2 prisoten v apikalnih membranah enterocitov,ledvica-proksimalne tubule in druge celice [105]. Toksičnost OTA so pripisali njegovemu izokumarinskemu delu in dobro je znano, da je OTA inaktiviran ali bioaktiviran z encimi citokroma P450 [29]. Prej je bila prisotnost OTA v krmi povezana z razvojem nefrotoksičnosti, ki je bila pri podganah povezana zledvičnaadenomi inledvicatumorji [97]. V pričujoči študiji so ugotovili zmanjšanje izražanja MRP2 v jetrih, kar kaže na poslabšanje izločanja mikotoksinov v skupini E2.

Pri podganah so opazili, da se OTA izloča 15 odstotkov manj v proksimalnih tubulihledvica,medtem ko proksimalni tubularni transport aminokislin ni bil oslabljen [97, 106]. Zato bi lahko zmanjšanje MRP2 v jetrih, ugotovljeno v tej študiji, mehanizem, prek katerega mikotoksini dosežejo visoke odstotke biološke uporabnosti in vivo . Na ta način bi se povečala izpostavljenost pujskov AFB1 in OTA, kar bi prispevalo k hepatotoksičnosti. Glede na nefrotoksični potencial OTA in AFB1 ima lahko zmanjšanje produkta gena MRP2 tudi velik vpliv na proksimalni tubul, kar vodi do zmanjšane sposobnosti za izločanje OTA [97]. Vendar pa so potrebne nadaljnje študije o transportnem mehanizmu AFB1 in OTA, da bi podprli to hipotezo. V fazi II metaboličnega razstrupljanja se prvotna ksenobiotična spojina ali vmesni metaboliti, spremenjeni med fazo I, konjugirajo, da so primerni za izločanje. Glutation S transferaze (GST) in UDP glikuroziltranferaze (UGT) prispevajo k obdelavi faze II [107].

V prisotnosti mešanice stranskih produktov moke iz grozdnih pečk in rakitovca v krmi za prašiče se raven izražanja GSTA1 v jetrih znatno poveča, verjetno zaradi elementa, ki se odziva na antioksidante (ARE) in elementa, ki se odziva na -NF (-NF-RE), ki v prisotnosti fenolnih antioksidantov aktivirajo izooblike GST brez potrebe po arilnih ogljikovodikovih (Ah) receptorjih [108]. Presenetljivo je, da v študiji Ghadirija et al. (2019) [109] so v kravjih jetrih v prisotnosti antioksidanta opazili znižanje regulacije mRNA GSTA1, posredovano z AFB1-. Prejšnje študije [110] so pokazale, da OTA in AFB1 tekmujeta za iste encime CYP450, ki predstavljajo bioaktivacijsko pot AFB1, pri čemer nastaja manj aduktov AFB1-DNA. Zaradi te konkurence bi lahko AFB1 verjetno konjugirali z reduciranim glutationom v reakciji, ki jo katalizirajo encimi GST, pri čemer so njihovi geni za kodiranje regulirani navzgor. AFB1 je lahko vključen v druge vrste reakcij faze II, tj. glukuronidacijo in sulfatacijo, medtem ko je OTA večinoma konjugiran z reduciranim glutationom [72]. Poleg tega je kot odgovor na sočasno dajanje pri prašičih krma dveh mikotoksinov (AFB1 in OTA) povečala nastajanje biomarkerjev oksidativnega stresa. Zato so se aktivirali obrambni mehanizmi, ki spodbujajo prilagajanje in preživetje kot odgovor na oksidativni stres [111]. Na primer, ROS in oksidanti lahko aktivirajo transkripcijo izooblik GST prek ARE [108], kot so opazili v jetrih inledvices povečanjem stopnje izražanja gena GSTA1.

Sklepi

Naši podatki so razkrili obstoj razlik med pujskiledvicain jeter glede reakcije proti mikotoksinom in stranskim produktom, uporabljenim v tej študiji. Na splošno so stranski produkti z antioksidativnim delovanjem zmanjšali izražanje analizirane mRNA CYP v jetrih in ga povečali vledvica. Tudi v obeh organih je sočasna izpostavljenost pujskov OTA in AFB1 povzročila povečanje ali zmanjšanje izražanja genov, odvisno od tipa gena. Vključitev moke iz grozdnih pečk in rakitovca v prehrano prašičev, zastrupljenih z OTA in AFB1-, je zmanjšala ekspresijo gena CYP P450, kar kaže na zmanjšanje bioaktivacije teh mikotoksinov, kar je verjetno povzročilo zmanjšano toksičnost v obeh organih, saj histološke študije so pokazale. Te ugotovitve kažejo, da so odpadki moke iz grozdnih pečk in rakitovca obetaven vir za preprečevanje škodljivih učinkov ohratoksina A in aflatoksina B1. Čeprav je potrebno dodatno delo, da bi razkrili mehanizme, s katerimi stranski produkti grozdnih pečk in rakitovca vplivajo na biotransformacijo AFB1 in OTA in s tem na nastanek toksičnih metabolitov, se zdi, da so zaščitni učinki vsaj delno posredovani z izboljšanjem antioksidativne obrambe v jetrih. inledvicaravni.

Materiali in metode

Eksperimentalno načrtovanje in zbiranje vzorcevŠtirideset križanih TOPIGS-40 hibridov (♀ Large White × Hybrid (Large White × Pietrain) ×♂ Talent, predvsem Duroc) pujskov po odstavitvi s povprečno telesno težo 9,11 ± 0.{{16 }}3 kg je bilo dodeljenih trem poskusnim skupinam (E1, E2, E3) in eni kontrolni skupini (C), ki so bile nameščene v boksih (dve ponovitvi po pet prašičev na boks na zdravljenje) in hranjene s poskusnimi dietami 3{{19} } dnevi. Krmo in vodo smo med poskusom ponujali ad libitum. Bazalna prehrana je služila kot kontrola in je vsebovala običajno krmno mešanico za prašičke začetnike brez mikotoksina (68,46 odstotkov koruze, 19 odstotkov sojine moke, 4 odstotke koruznega glutena, 5 odstotkov mlečnega nadomestka, L-lizina 0.3 odstotka, DL-metionin 0.1 odstotek, apnenec 1,57 odstotka, monokalcijev fosfat 0.35 odstotkov, sol 0,1 odstotka, holin premiksi 0,1 odstotka in 1 odstotek vitaminsko-mineralni premiksi). Eksperimentalne skupine so bile hranjene na naslednji način: E1 - bazalna prehrana plus mešanica (1:1) dveh stranskih produktov (moka iz grozdnih pečk in rakitovca) v odstotkih 5 odstotkov z zamenjavo koruzne in sojine moke; E2—bazalna prehrana, umetno kontaminirana z mikotoksini (mešanica 62 ppb aflatoksina B1- AFB1 in 479 ppb okratoksina A-OTA); in E3—bazalna dieta, ki vsebuje 5 odstotkov mešanice (1:1) moke iz grozdnih pečk in rakitovca in je kontaminirana z mešanico AFB1 in OTA. Mešanico mikotoksinov OTA in AFB1 sta prijazno zagotovila dr. Boudra in dr. Morgavi iz INR A, Center v Clermont Ferrandu, proizvedena pa je bila z gojenjem Aspergillus flavus in Aspergillus ochraceous na pšenici, kot so že opisali Boudra et al. [ 112 ]. Dobljeni kontaminirani material je bil vključen v diete za skupine E2 in E3, kar je povzročilo končno koncentracijo 479 ppb OTA in 62 ppb AFB1. Živali iz vseh poskusnih skupin so imele prost dostop do krme in vode za zdravljenje vsak dan poskusnega obdobja (30 dni). Moko iz grozdnih pečk in rakitovčevo moko sta zagotovili dve lokalni komerciali, SC OLEOMET-SRL in BIOCATINA, Bukarešta, Romunija. Po 4 tednih so bile živali zaklane z odobritvijo Etičnega odbora Nacionalnega raziskovalno-razvojnega inštituta za prehrano in biologijo živali, Balote s , ti, Romunija (Etični odbor št. 118/02.12.2019) in v skladu z Romunski zakon 206/2004 in Direktiva Sveta EU 98/58/ES o ravnanju in zaščiti živali, ki se uporabljajo v poskusne namene. Ob koncu poskusnega obdobja te študije so izmerili proizvodne parametre, težo in porabo krme. Jetra inledvicavzorci so bili zbrani pri štirih živalih na skupino in perfundirani z ledeno mrzlo fiziološko raztopino za odstranitev krvi. Fragmenti ~ 50 mg iz desnega jetrnega režnja inledvičnaskorje (tri iz vsakega) smo zbrali v stabilizacijskem reagentu RNAlater (Qiagen, Germantown, Maryland) in nato shranili pri – 80 ◦ C do koraka izolacije RNA. Zaradi etičnih razlogov, čim večje uporabe vsake živali, zmanjšanja izgube živali in statistične analize je bilo število osebkov zmanjšano, kolikor je bilo znanstveno mogoče. Dobra znanost in dobra eksperimentalna zasnova pomagata zmanjšati število živali, uporabljenih v kateri koli raziskovalni študiji, kar znanstvenikom omogoča zbiranje podatkov z najmanjšim potrebnim številom živali [113].

Karakterizacija krmeKrmne obroke smo analizirali glede bazalne kemične sestave (suha snov, surove beljakovine, surova maščoba, surova vlaknina in pepel) po metodah Mednarodne organizacije za standarde (SR ISO 6496/2001, Standardizirani bilten (2010). http://www. asro.ro (dostopano 13. februarja 2021)). Bioaktivne spojine iz obrokov stranskih produktov, kot so polifenoli, polinenasičene maščobne kisline (PUFA) in minerali, so bile določene z reakcijo Folin-Ciocalteu, HPLC-UV-Vis in plinsko kromatografijo, kot so opisali avtorji [113, 114]. Antioksidativno delovanje je bilo določeno z metodo DPPH, kot so predhodno opisali avtorji [115].

Analiza plazemskih biomarkerjev30. dan so bili aseptično odvzeti vzorci krvi pujskov na tešče. Označevalci, ki odražajo delovanje jeter (aspartat transaminaza-AST, alanin transaminaza-ALT, gama glutamil transferaza-GGT, skupne beljakovine, alkalna fosfataza-AKL) in ledvic (albumin, kreatinin), so bili določeni po centrifugiranju krvi z uporabo namizne naprave Clinical Chemistry. analizator Horiba Medical—ABX Pentra 400, (Irvine, CA, ZDA).

Pregled s svetlobno mikroskopijoJetra inledvicabiopsije so bile fiksirane v 4-odstotni raztopini formaldehida s fosfatnim pufrom, dehidrirane, zbistrene in vključene v parafinske bloke. Odseki velikosti 5 µm so bili rutinsko obdelani za barvanje s hematoksilin-eozinom in trikromom Gomori (Leica Biosystems, 38016SS1, Nussloch, Nemčija) v skladu s protokolom Leica. Mikroskopske reze smo analizirali z mikroskopom Olympus BX43, opremljenim z digitalnim fotoaparatom Olympus XC30. Histopatološke spremembe jeter inledvicaso bili glede na resnost lezij razvrščeni v stopnje 1–4, kot je opisano prej [116]. Za jetra, stopnja 1: normalen vidik; stopnja 2: normalni hepatociti, rahlo razširjeni sinusoidi in kongestija; stopnja 3: vakuolizirani hepatociti, razširjeni sinusoidi in kongestija; zmerna proliferacija kolagena; stopnja 4: nekroza, vnetni infiltrati, proliferacija kolagena. Za ledvice, stopnja 1: normalen vidik; stopnja 2: rahle tubularne/glomerularne poškodbe, vnetje in proliferacija kolagena; stopnja 3: blage tubularne/glomerularne poškodbe, vnetje in proliferacija kolagena; stopnja 4: izrazite tubularne/glomerularne poškodbe, vnetje in proliferacija kolagena. "Povprečna ocenjevalna vrednost" (MAV) je bila izračunana kot povprečje vseh podatkov na eksperimentalno skupino.

Izolacija RNAIzolacija celotne RNA je bila izvedena iz 10 mg tkiva z uporabo RNeasy Plus Universal Mini Kit (Qiagen) po protokolu proizvajalca. Poleg tega je vključeval korak razgradnje DNaze na koloni. Po izolaciji RNA smo naredili alikvote, da bi preprečili razgradnjo, ki jo povzročijo cikli zamrzovanja in odmrzovanja. Koncentracijo in čistost celotne RNA smo določili s spektrofotometrom NanoDrop 8000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, ZDA).

Številka integritete RNA (RIN)Vrednosti RIN vzorcev RNA so bile določene z uporabo Agilent RNA 6000 NanoKit (Agilent, Santa Clara, CA, ZDA) in Agilent 2100 Bioanalyzer z uporabo protokola proizvajalca. Vzorci z vrednostmi RIN, manjšimi od 8, niso bili vključeni v nadaljnjo analizo in koraki izolacije so bili ponovljeni.

Povratni prepisZa sintezo cDNA smo 1000 ng celotne RNA podvrgli reverzni transkripciji z uporabo kompleta za sintezo cDNA iScript (Bio-Rad, Hercules, CA, ZDA). 4 µL reakcijske mešanice in 1 µL reverzne transkriptaze smo zmešali z 1 µL vzorcev RNA in dopolnili z vodo brez RNaze do skupnega volumna 20 µL. Končna koncentracija RNA je bila 1000 ng na reakcijo. Reakcija je bila izvedena z uporabo Veriti 96-Well termalnega ciklerja (Applied Biosystems, Foster City, CA, ZDA) z naslednjim programom: en cikel 25 °C 5 minut, en cikel 42 °C 30 minut in en cikel 85 ◦ C za 5 minut. Koncentracijo in čistost vzorcev cDNA smo določili s spektrofotometrom NanoDrop 8000 (Thermo Scientific).

Primerno oblikovanjeZaradi pomanjkanja podatkov o genih, ki sodelujejo pri hepato-nefrotoksičnosti pri izpostavljenosti odstavljenih prašičev mikotoksinom, so bile sekvence primerjev (tabela 7) oblikovane in silico z uporabo Primer3Plus [59] in preverjene s programom BLAST [117]. Izbrani so bili tisti z največjo specifičnostjo za ciljno zaporedje, da bi pomnožili gene CYP1A2, CYP2A19, CYP2E1, CYP3A29, CYP4A24, MRP2 in GSTA1 ter tri referenčne gene, ki kodirajo za vezavni protein TATA-box, ribosomski protein L4 in beta{ {19}}mikroglobulin v Sus scrofa. Temperature žarjenja primerjev so bile določene s temperaturnim gradientom PCR.

PCR v realnem časuReakcija PCR v realnem času je bila izvedena na sistemu iCycler iQ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad) z uporabo iQ SYBR Green SuperMix (Bio-Rad). V 96-ploščo z vdolbinicami 1 µL 1{{10}}0 ng/ µL cDNA, 12,5 µL iQ SYBR Green SuperMix (Bio-Rad), 0,5 Dodali smo µL 20 pmol/µL prednjega primerja, 0,5 µL 20 pmol/µL povratnega primerja in 10,5 µL vode MilliQ. Skupna prostornina je bila 25 µL. Program pomnoževanja je bil sestavljen iz 1 cikla 95 ◦ C za 5 minut, 45 ciklov 95 ◦ C za 30 s, 55/56 ◦ C za 30 s, 72 ◦ C za 45 s in 85 ciklov pri 55 ◦ C, s povišanjem nastavljene temperature za 0,5 ◦ C na cikel za 10 s. Vzorci so bili zagnani in zabeležene so bile vrednosti pragovnih ciklov (Ct). Izvedene so bile tudi talilne krivulje.

Analiza podatkovVrednosti Ct so bile obdelane, kot je navedeno v "Smernicah MIQE: Minimalne informacije za objavo kvantitativnih poskusov PCR v realnem času" [ 118 ] z uporabo OpenOffice Calc v skladu z metodo 2- ∆∆ Ct, ki sta jo opisala Livak in Schmittgen (2001). ) [ 119 ]. Referenčni geni (TBP, RPL4 in B2M) so bili izbrani tako, da so bili stabilno izraženi v različnih tipih tkiv in zdravljenjih na vzorcih prašičev [120, 121]. Relativna vrednost izražanja (2 − ∆∆Ct ) je bila pridobljena z normalizacijo, pri čemer se je od vsakega zanimivega gena odštela aritmetična sredina referenčnih genov. Tehnične ponovitve so bile povprečene pred statistično analizo. Podatki so prikazani kot povprečne vrednosti skupin (n=4) ± standardna napaka odklona povprečja (STDEV). Vsi podatki so bili statistično analizirani z uporabo enosmerne metode ANOVA, izvedene s programsko opremo GraphPad Prism 3.03 (GraphPad Software, La Jolla, CA, ZDA). Post hoc primerjave med vsemi skupinami so bile izvedene z uporabo Bonferronijevega testa. Statistična značilnost (vrednost p) je bila predstavljena za vse skupine v nasprotju s kontrolno skupino (C).