Funkcionalne lastnosti beljakovin se lahko izboljšajo s hidrolizo z nekaterimi proteazami

Prosim kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza več informacij

Povzetek:Da bi raziskali metode za izboljšanje predelave prašičjih odpadkov, smo prašičjo kožo hidrolizirali z uporabo različnih komercialno dostopnih proteaz (Alkalaza, Flavorzyme, Neutrase, Bromelain, Protamex in Papain) v več optimalnih pogojih. Po encimski hidrolizi smo hidrolizate kolagena (CH) frakcionirali po molekulski masi (3 kDa) z membransko ultrafiltracijo. CHS so analizirali glede na fizikalne lastnosti (pH, izkoristek beljakovin, vsebnost prostih amino skupin, porazdelitev molekulske mase in sestavo aminokov) ter funkcionalne lastnosti (antioksidativne aktivnosti in aktivnosti proti staranju). Med CH-ji so CH-ji, hidrolizirani z Alkalazo (CH-Alkalaza), pokazali najvišjo stopnjo hidrolize v primerjavi z drugimi CH-ji. Tako "CH-alkalaza" kot "CH-alkalaza".<3 kda"="" fractions="" showed="" a="" considerably="" high="" antioxidant="" activity="" and="" collagenase="" inhibition="" activity.="" therefore,="" resulting="" bioactive="" have="" the="" potential="" for="" development="" as="" antioxidants="" and="" anti-aging="" ingredients="" in="" the="" food,="" cosmetics,="" and="" pharmaceuticals,="" from="" animal="">

Ključne besede:hidroliza; komercialne proteaze; hidrolizat kolagena; antioksidant; proti staranju

KSL29

Za več informacij kliknite tukaj

1. Uvod

S podaljševanjem pričakovane življenjske dobe se veliko pozornosti namenja postopkom proti staranju kože. Kolagen, ki se uporablja v izdelkih za nego kože kot kozmecevtska sestavina za preprečevanje staranja, se pogosto uporablja na kozmetičnem trgu. Kolagen je visokomolekularna vlaknasta beljakovina živalskega izvora, ki jo v izobilju najdemo v vezivnem tkivu, koži, kitah, hrustancu, vezeh, zobeh, nohtih in laseh ljudi in živali. Živina ostaja glavni vir industrijskega kolagena[1]. Živilska in mesnopredelovalna industrija vsako leto po vsem svetu kot odpadke zavržeta velike količine živinorejskih stranskih proizvodov. Vendar pa jih je mogoče uporabiti kot pomembne beljakovinske vire za nove živilske materiale ali pretvoriti v izdelke z dodano vrednostjo s hidrolizo, ki se pogosto uporablja za izboljšanje in nadgradnjo funkcionalnih in prehranskih lastnosti beljakovin [2,3]. Kolagen vse bolj velja tudi za vir bioaktivnih peptidov, ki so obetavni kot koristne spojine za uporabo v prehranskih ali farmacevtskih aplikacijah.koristi cistanche,Zato ima lahko hidroliza kolagena pomembno vlogo pri izboljšanju njegove biološke uporabnosti in primernosti za uporabo v različnih komercialnih procesih.

Fiziološke aktivnosti bioaktivnih peptidov, ki običajno vsebujejo 2-20 aminokislinskih ostankov (<6000 da),="" are="" based="" on="" the="" composition="" and="" sequence="" of="" their="" amino="" acids="" [2,4].="" due="" to="" their="" structural="" properties="" such="" as="" molecular="" weight,="" bioactive="" peptides="" may="" possess="" specific="" characteristics="" that="" affect="" numerous="" physiological="" processes="" related="" to="" antimicrobial,="" antioxidant,="" emulsifying,="" antihypertensive,="" antidiabetic,="" and="" immunomodulatory="" functions="" in="" organisms[1,5,6].="" generally,="" low="" molecular="" weight="" hydrolysates="" display="" lower="" viscosity,="" better="" dispersion,="" higher="" hydrophobicity,="" and="" smaller="" particle="" size="" [7].="">cistančni holesterolStopnja hidrolize neposredno vpliva na molekulsko maso in aminokislinsko sestavo hidrolizatov [8]. Zato je lahko postopek hidrolize potreben za proizvodnjo novih bioaktivnih peptidov.

KSL30

Cistanche lahko upočasni staranje

Hidrolizo beljakovin, ki vodi do cepitve peptidnih vezi, lahko izvedemo preko encimskih ali kemičnih procesov [9]. Kemični procesi, vključno z alkalno ali kislo hidrolizo z uporabo ekstrakcij s topilom, so škodljivi ne le za okolje, ampak tudi za ljudi, ki uživajo nastale izdelke [4, 10]. Kemični procesi, ki jih je težko nadzorovati, dajejo produkte, ki vsebujejo modificirane aminokisline [9]. V nasprotju s tem se lahko encimska hidroliza izvede v blagih pogojih, s čimer se izognemo ekstremnim okoljem, ki jih zahtevajo kemične obdelave. Poleg tega procesi niti ne povzročajo stranskih reakcij niti ne zmanjšujejo hranilne vrednosti vira beljakovin [8]. Več proteaz, vključno z alkalazo, pepsinom, protamexom, tripsinom in nevtrazo, se pogosto uporablja za hidrolizo beljakovin, kar ima za posledico različne vrste proteinskih hidrolizatov in peptidov z različnimi biofunkcionalnimi aktivnostmi. Ena študija je poročala o proizvodnji hidrolizatov kolagena z antioksidativnim delovanjem iz želatine prašičje kože z uporabo encimske hidrolize s pepsinom in pankreatinom [11].cistanche deserticola neželeni učinkiStranski proizvodi lososa so bili hidrolizirani za proizvodnjo peptičnih hidrolizatov z uporabo različnih proteaz, kjer so končni peptidi pokazali odlične antioksidativne in protivnetne lastnosti [12].

Cilj raziskave je bil: (a) identificirati najaktivnejše kolagenske hidrolizate, proizvedene z encimsko hidrolizo z uporabo različnih komercialno dostopnih proteaz (Alcalase, Flavorzyme, Neutrase, Protamex, Bromelain in Papain); (b) potrditi učinek frakcioniranja hidrolizate kolagena, pridobljene z encimsko hidrolizo, in (c) za določitev njihovih in vitro antioksidativnih aktivnosti in aktivnosti proti staranju.

2. Rezultati in razprava

2.1. Učinek encimske hidrolize na kolagenske hidrolizate

2.1.1.pH

Funkcionalne lastnosti beljakovin se lahko izboljšajo s hidrolizo z nekaterimi proteazami. V tej študiji je bilo za hidrolizo kolagena iz prašičje kože uporabljenih šest različnih proteaz (Alcalase, Flavorzyme, Neutrase, Bromelain, Protamex in Papain), da bi dobili aktivne hidrolizate kolagena z nizko molekulsko maso.cistanche odmerek redditSprememba pH v hidrolizatih kolagena (CH) je prikazana na sliki 1. pH suspenzije kolagena (5-odstotna mešanica prašičje kože) je bil na začetku 6.39-6.55 (pri 0h). CH-Alkalaza in CH-Flavorzyme sta dosegla optimalen pH (pH 8.0) pri 12 urah inkubacije. CH-Protamex, CH-Bromelain in CH-Papain so dosegli optimalen pH (pH7.0) pri 6 urah inkubacije, medtem ko je CH-Flavorzyme še naprej padal s pH6,39 na pH5,69 v 24-urni inkubaciji (slika 1). pH beljakovinskega hidrolizata je pomemben dejavnik, ki uravnava reakcije encimske hidrolize[13]. Zato je lahko nastajanje hidrolizatov kolagena v pogojih različnega pH posledica od pH odvisnih sprememb konformacije encimov, kar lahko vpliva na njihovo bioaktivacijo in fizikalno-kemijske lastnosti.

2.1.2. Elektroforeza z natrijevim dodecil sulfatom in poliakrilamidnim gelom (SDS-PAGE)

Prikazani so profili elektroforeze z natrijevim dodecil sulfatom in poliakrilamidnim gelom (SDS-PAGE) CHs, obdelanih z različnimi proteazami 24 ur (slika 2). Peptidni profil kolagenske suspenzije (pri 0 h) je pokazal viden pas v območju nizke do visoke molekulske mase. Rezultati so pokazali hitro hidrolizo v CH-alkalazi, CH-nevtrazi, CH-bronnelinu in CH-Protamexu, saj po 3 urah inkubacije ni bilo pasov. Pasovi visoke molekulske mase za CH-alkalazo, CH-nevtrazo in CH-Protamex so se zmanjšali v odvisnosti od časa inkubacije. Vendar se CH-Bromeline ni spreminjal s časom inkubacije, ker je pivo popolnoma hidrolizirano po samo 1 uri inkubacije. Zanimivo je, da so CH popolnoma izginili, ko je vzorec 6 ur reagiral z alkalazo ali nevtrazo, kar kaže, da je kolagen deloval kot primeren substrat za nekatere druge testirane encime.koristi izvlečka cistanche,Vendar pa so se pasovi CH-Flavorzyme in CH-Papain pojavili v območju nizke do visoke molekulske mase po 24 urah. Beljakovine je mogoče delno hidrolizirati v peptide ali aminokisline z encimsko hidrolizo, odvisno od vrste proteaze, inkubacijskega časa in razmerja med proteazo in substratom (količina beljakovin) [14]. Proces encimske hidrolize je v glavnem odvisen od tega, ali je vključena vrsta proteaze endopeptidaza ali eksopeptidaza [15,16]. Ker so alkalaza, nevtraza in protamex endopeptidaze, se lahko pričakuje, da bodo njihovi procesi hidrolize naključno pretrgali peptidne vezi iz neterminalnih aminokislin in s tem olajšali nadaljnjo hidrolizo proteinov. Po drugi strani pa je Flavorzyme endo- in eksopeptidaza, ki prekine ne- ali N-terminal peptidnih verig. V tej študiji je kolagenski protein vseboval vezavna mesta, ki so bila bolj dovzetna za aktivnost eksopeptidaze kot za aktivnost endopeptidaze zdravila Flavorzyme. Tako je zaradi aktivnosti eksopeptidaze hidroliza kolagenskih proteinov s Flavorzymeom vključevala postopno prekinitev peptidnih vezi z N-terminala aminokislin, kar je upočasnilo hidrolizo beljakovin.

2.1.3. Obnovitev beljakovin in vsebnost prostih amino skupin

Prikazana je predelava beljakovin CH, pridobljenih z različnimi komercialnimi proteazami (slika 3A). Kontrola (suspenzija kolagena) je imela vsebnost izkoristka beljakovin 1,19 mg/mL. Rekuperacija beljakovin je parameter učinkovitosti encimske hidrolize. Nizka vsebnost obnovitve beljakovin v CH kaže na povečano razgradnjo beljakovin. Poleg tega je predelava beljakovin v dobri korelaciji s topnostjo beljakovin. Večjo hidrolitično aktivnost lahko povzroči povečanje izpostavljenih hidrofobnih stranskih verig, kar vodi do povečanih hidrofobnih interakcij med proteini in/ali peptidi. Te hidrofobne stranske verige lahko vodijo do zmanjšane topnosti beljakovin, kar povzroči povečano pridobivanje beljakovin v hidrolizatih. V naši študiji je bila vsebnost obnovitve beljakovin dobro povezana s spremembami v vzorcih SDS-PAGE. Najnižja in najvišja raven rekuperacije beljakovin je bila zabeležena za hidrolizo Alcalaze oziroma Flavorzyme. Za učinkovitost hidrolize, povezano s časom inkubacije, so se CH-Alkalaza, CH-Bromelain in CH-Protamex drastično zmanjšali v eni uri inkubacije v primerjavi s kontrolo. Zmanjšanje vsebnosti obnovitve beljakovin, ki je posledica hidrolize beljakovin, je pokazalo obratno razmerje z vsebnostjo amino skupin. Poleg tega je večina CH, razen CH-nevtraze, pokazala nizko vsebnost beljakovin med 3 in 12 urami. Po 24 inkubacijah se je njihova vsebnost beljakovin ponovno povečala v CH-Alkalase, CH-Flavorzyme, CH-Neutrase, CH-Bromeline, CH-Protamex in CH-Papain, kot sledi:0.83 mg/mL, 1,29 mg/ mL, 0.75 mg/mL, 0.97 mg/mL, 0.77 mg/ml oziroma 1,11 mg/mL. Nekatera poročila kažejo, da je optimalni čas hidrolize odvisen od več dejavnikov, kot so izbrana vrsta, surovina, uporabljeni encim, stopnja surovine/encima, koncentracija encima in želena stopnja hidrolize itd. [16] ]. Nekatera poročila kažejo, da lahko podaljšana encimska hidroliza (več kot 24 ur) povzroči zmanjšanje aktivnosti proteaze; zato je treba encimsko hidrolizo izvesti v 24 urah po encimski hidrolizi [17,18].

KSL19

The free amino group content of CH, which is an indicator of enzymatic hydrolysis efficiency, was estimated(Figure 3B). The expected outcome of protein breakdown is that protein may be hydrolyzed into shorter peptide products. The free amino group content of the control was initially 0.14 mg/mL. The free amino group content of all CHs dramatically increased with increasing incubation time. After 24 h incubation, the free amino group content by descending order was: CH-Alcalase (1.00 mg/mL)>CH-Protamex(0.70 mg/mL)> CH-Neutrase(0.68 mg/mL)>CH-Bromeline (0.67 mg/mL)>CH-Flavorzyme (0.53 mg/mL)>CH-papain (0.40 mg/mL). Pogoste razlike v vsebnosti skupnih beljakovin ali prostih amino skupin v encimsko hidroliziranih vzorcih so lahko povezane s specifičnostjo encima. Odvisen je od lastnosti encima med procesom encimske hidrolize [16,17]. Na primer, alkalne proteaze (kot je alkalaza) kažejo višje hidrolitske aktivnosti v primerjavi s kislimi ali nevtralnimi proteazami.

2.2. Učinek ultrafiltracije na lastnosti kolagenskega hidrolizata

Postopek ultrafiltracije je lahko uporabna, industrijsko ugodna metoda za proizvodnjo majhnih peptidnih frakcij z želeno molekularno velikostjo in visoko bioaktivnostjo, odvisno od sestave izhodnega hidrolizata in aktivnosti, ki jo proučujemo [19]. Prikazana je topnost, vsebnost prostih amino skupin in izkoristek CH po liofilizaciji (tabela 1). Topnost in vsebnost prostih amino skupin kontrole sta bili 11,95 odstotka oziroma 0.79 odstotka. Po encimski hidrolizi in ultrafiltraciji z mejno vrednostjo molekulske mase 3 kDa so največjo topnost (21,17 odstotka) in vsebnost prostih amino skupin (14,17 odstotka) opazili pri CH-alkalazi<3 kda.="" however,=""><3kda was="" the="" lowest="" field="" (12.42%)observed.="" therefore,="" although="" ultrafiltration="" is="" useful="" in="" separating="" chs="" with="" low="" molecular="" weight,="" it="" may="" cause="" a="" reduction="" in="">

Povprečna molekulska masa beljakovinskih hidrolizatov je pomemben dejavnik, ki določa njihove biološke lastnosti [19]. Na splošno povprečni delež z MW<3 kda="" represents="" a="" collagen="" hydrolysate;="" an="" average="" fraction="" with="" mw=""> 50 kDa represents gelatin, and an average fraction with MW>300 kDa predstavlja kolagen [20,21]. Porazdelitev relativne molekulske mase kontrole (vzorca predhodne obdelave), CH-alkalaze in CH-alkalaze<3 kda="" is="" depicted="" in="" figure="" 4.="" the="" molecular="" weight="" distribution="" was="" over="" 20,100="" da="" for="" the="" control,="" which="" did="" not="" include="" the="" collagen="" hydrolysate=""><3 kda).="" this="" could="" not="" be="" numerically="" provided="" in="" this="" study,="" as="" the="" detection="" limit="" of="" the="" index="" detector="" system="" only="" ranged="" from="" 106="" to="" 20,100="" da.="" however,="" ch-alcalase="" showed="" detectable="" values="" in="" a="" higher="" range="" of="" relative="" molecular="" weight="" distribution,="" which="" ranged="" from="" 20,100="" da="" to="" 4270="" da="" (maximum="" peak:12,600="" da).in="" ch-alcalase=""><3 kda,="" the="" molecular="" weight="" distribution="" mainly="" showed="" three="" peaks:="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 4270="" da(maximum="" peak),="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 424="" da,="" and="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 222="" da="" and="" 102="" da.="" ultrafiltration="" is="" an="" effective="" purification="" method="" used="" to="" obtain="" low="" molecular="" weight="" peptides="" from="" crude="" hydrolysates.="" results="" indicated="" that="" enzymatic="" hydrolysis="" by="" alcalase="" clearly="" reduced="" the="" high="" mw="" of="" the="" control="" (either="" collagen="" or="" gelatin),="" and="" that="" ultrafiltration="" was="" an="" effective="" purification="" method="" that="" can="" be="" used="" to="" obtain="" low="" molecular="" weight=""><3 kda)="" from="" crude="" collagen="" hydrolysates.="" reportedly,="" low="" molecular="" weight="" peptides="" (2-20="" amino="" acids)="" are="" more="" biologically="" active="" compared="" to="" their="" parent="" polypeptide/="" proteins,="" which="" are="" larger="">

KSL20

Prikazana je aminokislinska sestava v CH (tabela 2). CHS z različnimi proteazami je imel različne aminokislinske sestave in antioksidativne lastnosti [23]. Aminokislinska sestava kolagena je bila bogata z glicinom (Gly), prolinom (Pro) in glutaminsko kislino (Glu). Vsebnost aminokislin v CHs(CH-alkalazi in CH-alkalazi<3 kda)="" increased="" more="" than="" that="" of="" the="" control,="" following="" enzymatic="" hydrolysis="" with="" or="" without="" ultrafiltration.="" in="" particular,="" the="" content="" of="" gly,="" pro,="" and="" glu="" was="" much="" higher="" in=""><3 kda(gly="" 218="" mg/g,="" pro="" 152="" mg/g,="" and="" glu="" 120="" mg/g)="" than="" ch-alcalase(gly149="" mg/g,="" pro="" 95mg/g,="" and="" glu78="" mg/g).="" an="" increase="" in="" the="" content="" of="" these="" amino="" acids="" is="" strongly="" related="" to="" enhanced="" antioxidant="" capabilities="" 16,20].="" gly="" and="" pro="" contain="" hydrophobic="" amino="" acid="" groups,="" and="" glu="" contains="" negatively="" charged="" amino="" acid="" groups.="" these="" amino="" acids="" have="" been="" reported="" to="" enhance="" antioxidant="" activity="" because="" of="" their="" increased="" solubilities="" in="" lipids="" or="" via="" free="" radical="" reactions="">