Od beljakovin neodvisna vloga fosfata pri napredovanju kronične ledvične bolezni
Mar 20, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com
Irene Faria Duayer1 et al
Povzetek:Več dejavnikov prispeva kdelovanje ledviczmanjšanje števila bolnikov s kronično ledvično boleznijo, vloga vsebnosti fosfatov v prehrani pa je še vedno predmet razprave. Namen te študije je analizirati mehanizem, s katerim je fosfat, neodvisno od beljakovin, povezan z napredovanjem kronične ledvične bolezni. Odrasle podgane Munich-Wistar so bile podvržene nefrektomiji 5/6 (Nx), hranjene z dieto z nizko vsebnostjo beljakovin in razdeljene v dve skupini. Samo vsebnost fosfatov (nizka vsebnost fosfatov, LoP, 0.2 odstotka; visoka vsebnost fosfatov, HiP,0.95 odstotkov) je razlikovala diete. Po šestdesetih dneh so biokemični parametri inledvicaanalizirali histologijo. Skupina HiP je imela slabše delovanje ledvic z višjimi ravnmi PTH, FGF-23 in delnim izločanjem fosfata. Pri histološki analizi ledvičnega tkiva so pokazali tudi večji odstotek intersticijske fibroze, izražanja -aktina, PCNA inledvičnainfiltracija z makrofagi. Skupina LoP je v primerjavi s skupino HiP pokazala večjo izraženost beklina-1 v celicah ledvičnih tubulov, označevalca avtofagičnega izliva. Naše ugotovitve poudarjajo delovanje fosfata pri indukcijiledvicaintersticijsko vnetje in fibrozo, kar prispeva k napredovanju ledvične bolezni. Možen učinek fosfata na disregulacijo mehanizma avtofagije ledvičnih celic je treba dodatno raziskati s kliničnimi študijami.
Ključne besede:fosfat;prehrana; CKDnapredovanje;ledvičnafibroza; avtofagija;apoptoza
Ključni prispevek:Mehanizmi zaščite ledvic z omejevanjem fosfatne prehrane še niso določeni. V tej študiji je preobremenitev s fosfati vplivala na napredovanje kronične ledvične bolezni z aktivacijo vnetnih poti in indukcijoledvicaintersticijska fibroza. Učinek hiperfosfatemije na apoptozo ledvičnih celic in avtofagičnega kolega je treba dodatno raziskati.
Cistanche tubulosa preprečuje bolezni ledvic, kliknite tukaj za vzorec
1. Uvod
kroničnoledvicabolezen (CKD) velja za javnozdravstveni problem. Njegova razširjenost narašča s starostjo in se po vsem svetu giblje med 11 in 13 odstotki [1]. Čeprav je KLB na splošno ireverzibilno stanje, je mogoče uporabiti več pristopov za upočasnitev napredovanja bolezni, kot so nadzor krvnega tlaka, dislipidemije in hiperglikemije, uporaba zaviralcev angiotenzinske konvertaze in dieta z nizko vsebnostjo beljakovin [2–7]. . Med temi strategijami je dieta z nizko vsebnostjo beljakovin najbolj sporen predlog za odložitevledvicazaradi pomislekov glede njegove skladnosti, varnosti in učinkovitosti. Pomanjkanje soglasja o koristih zmanjšanja količine beljakovin v prehrani je odvisno od prekrivajoče se vloge vsebnosti beljakovin in fosfatov v prehrani. Ker so viri beljakovin bogati s fosfati, se priporoča zmanjšanje vnosa beljakovin, da dosežete omejen vnos fosfatov. Možno je omejiti beljakovine brez omejitve fosfata, čeprav je nasprotno težko.
V eksperimentalnih študijah je učinek diete z nizko vsebnostjo beljakovin zaščitil modele kronične ledvične bolezni pred poškodbami glomerulov in proteinurijo [8], kar je spodbudilo večje ohranjanje hitrosti glomerulne filtracije [9]. Opozoriti je treba, da so prehranske beljakovine in fosfati močno povezani. Čeprav so se nekatere eksperimentalne študije osredotočale na vrednotenje izoliranega učinka omejevanja beljakovin, so bile morda tudi pristranske zaradi nenamerne omejevanja fosfatov. Po drugi strani pa je bil jasno prikazan individualni prispevek diete, bogate s fosfati, k razvoju KLB [10,11]. Pokazalo se je, da prehrana z visoko vsebnostjo fosfatov povzroči več intersticijaledvicafibrozo in tubulno atrofijo z minimalno glomerulosklerozo pri uremičnih podganah. Zanimivo je, da je bila škoda zmanjšana po omejitvi fosfata [12]. Omeniti velja, da v tej študiji vsebnost beljakovin v prehrani ni bila omenjena.
V kliničnem scenariju je dieta z nizko vsebnostjo beljakovin zmanjšala koncentracijo uremičnih toksinov in ohranila preostalo ledvično funkcijo, tudi pri prehodu s konzervativne oskrbe na postopne režime dialize [13].Dietnabeljakovineomejitev je tudi upočasnila napredovanje KLB v nedavni metaanalizi [14]. Ker pa je bila omejitev beljakovin povezana z nižjimi ravnmi fosfatov v serumu, bi lahko ta koristen učinek prehrane deloma pojasnili z omejitvijo fosfatov. Največja prospektivna študija doslej, MDRD [15], je pokazala le majhno korist diete z nizko vsebnostjo beljakovin pri bolnikih z zmerno ledvično insuficienco, medtem ko pri bolnikih s hudo ledvično insuficienco napredovanje ledvične bolezni ni bilo prizadeto. Kljub temu v tem preskušanju niso obravnavali vsebnosti fosfata v prehrani in vpliva njegovega posameznega prispevka pri upočasnitviCKDnapredovanje ostaja neznano.
Znano je, da lahko fosfat zniža delovanje ledvičnega in krvnega obtoka Klotho [16], proteina proti staranju, ki sodeluje pri citoprotekciji in antifibrozi, z antioksidativnimi in antiapoptotičnimi učinki [17]. Poleg tega je bila že dokazana okvarjena avtofagija v ledvičnih celicah zaradi pomanjkanja Klotho [18]. Avtofagija je katabolični proces s kritičnimi funkcijami pri vzdrževanju celične homeostaze in ohranjanju sposobnosti preživetja celic v stresnih razmerah. Nekateri dokazi kažejo na povezavo med avtofagijo in napredovanjem kronične ledvične bolezni po različnih poteh, vključno s signalizacijo TGF [19], močnim fibrogenim dejavnikom za razvoj ledvične fibroze. TGF- vpliva na več bioloških procesov, uravnava celično proliferacijo in diferenciacijo, apoptozo in deluje tako, da se veže na specifične transmembranske receptorje, ki inducirajo znotrajcelično signalizacijo, posredovano s proteini SMAD [20]. Apoptoza je mehanizem programirane celične smrti, ki se razlikuje od nekroze. Fosfat je bil opisan kot mediator apoptoze v eksperimentalnih modelih endotelijskih [21], osteoblastnih [22] in peritonealnih mezotelijskih celic [23]. Obstajajo dokazi o sodelovanju apoptotične celične smrti pri napredovanjuledvicapoškodbe [24], vendar učinek fosfata na apoptozo ledvičnih celic še ni pojasnjen.
Ker mehanizem, s katerim dieta z visoko vsebnostjo fosfatov pospeši napredovanje kronične ledvične bolezni, še ni povsem pojasnjen, smo domnevali, da bi lahko bil povezan z disfunkcionalnim avtofagnim kolegom. Zato smo v trenutni študiji ovrednotili dve skupini podgan München-Wistar glede na vsebnost fosfatov v njihovi prehrani (nizka 0.2 odstotka v primerjavi z visoko0.95 odstotka) in preizkusili vpliv dieta z malo fosfatov naledvice' histološke in imunohistokemijske spremembe, vključno z markerjem avtofagije, beclin-1.
2. Rezultati
Hemodinamski, morfološki in biokemični parametri, pridobljeni iz skupin z nizko (LoP) in visoko fosfatno dieto (HiP), so podani v tabeli 1. Kot je bilo pričakovano, je nefrektomija 5/6- povzročila zmanjšanje očistka kreatinina in povečanje v serumski sečnini in kreatininu v obeh skupinah. Živali iz skupine HiP so pokazale nižjo ledvično funkcijo, kar dokazujeta višji kreatinin in nižji očistek kreatinina; pokazali so tudi nižji hematokrit in nižjo končno težo. Skupina HiP je pokazala povečanje serumskega in frakcijskega izločanja fosfata, pa tudi paratiroidnega hormona (PTH) in fibroblastnega rastnega faktorja-23 (FGF-23). Omeniti velja, da so bili kavdalni pritisk, začetna teža in izločanje albumina v urinu med skupinama podobni.
Histološki izvidi so prikazani na slikah 1–3. Glomeruloskleroza (GS) je bila komaj ugotovljena v obeh skupinah. Vendar pa je bil odstotek intersticijske fibroze znatno višji pri podganah v skupini HiP. Skladno s tem so imele te živali tudi višji odstotek z aktinom obarvanega območja gladke mišice in večjo ledvično infiltracijo z makrofagi, ovrednoteno z izražanjem ED-1, kot je prikazano v tabeli 2. Fosforilirano izražanje SMAD (p-SMAD), označevalec aktivacije poti TGF-beta, se med skupinami ni razlikoval.
V skupini HiP so prevladovale celice, pozitivne na proliferativni celični jedrski antigen (PCNA), kar kaže, da je preobremenitev s fosfati spodbudila intenzivnejšo proliferacijo ledvičnih celic. Nasprotno pa je bilo število apoptotičnih celic običajno večje v skupini LoP. Podobno je bilo beclin 1-pozitivnih celic bistveno več v tubulointersticijskih lezijah v skupini LoP, kar kaže na možen učinek višjega števila fosfatov pri zaviranju regenerativnega avtofagnega procesa naledvicatkivo.
3. Razprava
Ta eksperimentalna študija je preučevala, ali je omejitev fosfatov v prehrani učinkovit korak za upočasnitev napredovanja kronične ledvične bolezni, ne glede na sočasno omejitev beljakovin v prehrani. Preučili smo učinek diet z različnimi vsebnostmi fosfata ({{0}}.2 proti 0,95 odstotka) na živalskem modelu z nefrektomijo 5/6-, pri čemer so vse živali prejemale dieto z nizko vsebnostjo beljakovin (12 odstotkov). Naše ugotovitve so pokazale, da je dieta z visoko vsebnostjo fosfatov povezana s hiperfosfatemijo, kljub povečanju PTH, FGF-23 in posledično frakcijskega izločanja fosfata. Poleg tega je HiP povzročil okvaro delovanja ledvic in povečanje intersticijske fibroze, ki je bila povezana z višjo ekspresijo -aktina, infiltracijo makrofagov in celično proliferacijo ter zaviranjem avtofagije.
Metaanaliza 12 kohortnih študij, ki so vključevale 25.546 bolnikov s kronično ledvično boleznijo brez dialize, je pokazala neodvisno povezavo med koncentracijo fosfata v serumu,ledvicaneuspeh in smrtnost [25]. Poleg tega je retrospektivna kohortna študija pri 13.772 dializnih bolnikih razkrila povezavo med hiperfosfatemijo in drugimi nenormalnostmi kronične ledvične bolezni – mineralne in kostne motnje s strmejšim upadom preostaleledvicafunkcijo [26]. Mehanizem, s katerim omejevanje fosfatov upočasni napredovanje kronične ledvične bolezni, je treba še ugotoviti. V eksperimentalni študiji smo pokazali, da je s fosfati obogatena prehrana povezana z bolj oslabljenim delovanjem ledvic v primerjavi z dieto z nizko vsebnostjo fosfatov pri podganah Wistar, ki so bile podvržene paratiroidektomiji in 5/6-nefrektomiji z uporabo fiksirane obščitnice hormonski (PTH) dodatek [11]. Kusano et al. [10] je pokazalo, da je bila zaščita ledvične funkcije povezana z dieto z nizko vsebnostjo fosfatov (0,3 odstotka), ne glede na vsebnost beljakovin v prehrani pri uremičnih podganah. Podgane z običajno dieto s fosfati (0,5 odstotka) pa so te koristi pokazale le, če so bile hranjene z dieto z zelo nizko vsebnostjo beljakovin (8,4 odstotka). Ti rezultati skupaj kažejo, da je vloga prehranskih fosfatov morda močnejša od prehranskih beljakovin. Vendar pa nobena od zgoraj omenjenih študij ni poskušala raziskati možnih poti, ki bi lahko bile vpletene v poškodbe ledvic, povezane s fosfati.
Delovanje preobremenitve s fosfati pri napredovanju kronične ledvične bolezni je bilo predmet več študij. Etikete itd. prvič predlagal to možnost na živalskem modelu, vendar prehranske [27] beljakovine niso bile nadzorovane, kar je morda prikrilo izoliran učinek fosfata. Domnevna korist omejitve, neodvisne od fosfatov, namesto omejitve beljakovin v scenariju kronične ledvične bolezni je zelo zanimiva, saj lahko tveganje nadzora serumskega fosfata skupaj z omejenim vnosom beljakovin povzroči podhranjenost in povzroči večjo umrljivost.
Vsebnost fosfatov v prehrani ne določa nujno koncentracije fosfatov v serumu pri bolnikih s kronično ledvično boleznijo [28], kar poudarja pomen omejitve prehrane neodvisno od serumske koncentracije tega elementa. Patološki učinki fosfata na kosti in srčno-žilni sistem motivirajo posege za zdravljenje hiperfosfatemije. V klinični praksi intervencije za zmanjšanje ravni fosfatov vključujejo dietetične omejitve in vezalce fosfatov. Čeprav so bile koristi tega pristopa glede kliničnih končnih točk vprašljive v študiji majhnega vzorca [29], je ob spoznanju, da je presežek fosfata odgovoren za prekomerno proizvodnjo PTH in FGF -23, razumno vzdrževati ravni fosfata čim nižje pri bolnikih s kronično ledvično boleznijo [30].
Dieta z nizko vsebnostjo beljakovin povzroči nizko biološko uporabnost fosfata in zmanjša serumski FGF-23 [31,32], posrednika od natrija odvisne reabsorpcije fosfata na celicah ledvičnih tubulov. To nakazuje, da lahko na mehanizem uravnavanja fosfatov pri napredovali KLB nekako vpliva vnos fosfatov na povsem neodvisen način od vsebnosti beljakovin v prehrani. Iz tega razloga smo ovrednotili učinek vsebnosti fosfatov v prehrani na napredovanje kronične ledvične bolezni v modelu nefrektomije 5/6-. Prejšnja eksperimentalna študija je že pokazala, da lahko fosfat spremeni antiproteinurični odziv na dieto z zelo nizko vsebnostjo beljakovin (0,3 g/kg), pri čemer je pokazala korelacijo med koncentracijo fosfata v serumu in fosfaturijo z antiproteinuričnim odzivom na dieta z omejeno količino beljakovin, neodvisno od delovanja ledvic [33]. V navzkrižni študiji, ki je vključevala 11 bolnikov s kronično ledvično boleznijo (eGFR 30–55 ml/min/m2), je bil cirkadiani ritem serumskih fosfatov spremenjen z dieto z visoko vsebnostjo fosfatov, česar niso razložili z izločanjem fosfatov v urinu, PTH ali FGF -23 [34]. Ta rezultat krepi pomen omejitve fosfatne diete pri bolnikih s kronično ledvično boleznijo kot neodvisnega terapevtskega cilja.
Zdi se, da hemodinamski status ni vpleten v poslabšanje ledvične funkcije v skupini HiP, saj je bil arterijski tlak v obeh skupinah podoben. Poleg tega v našem modelu nismo našli pomembne glomerularne poškodbe, kar bi lahko razložili z omejitvijo beljakovin. Vendar pa smo opazili več intersticijske fibroze v skupini diete HiP.
Intersticijska fibroza je dobro povezana z izgubo delovanja ledvic pri ljudeh in podganah.
Prejšnja študija je povezala razvoj ledvične fibroze, ki jo povzroča dieta z visoko vsebnostjo fosfatov, preko peptidil-prolil izomeraze Pin 1 [35], medtem ko so drugi članki poudarili škodljivo vlogo pomanjkanja aKlotho naledvicatkivna fibroza [36,37]. Genetska delecija Klotho v eksperimentalnih modelih povzroča staranje, zaostajanje v rasti in kalcifikacije [38]. FGF23-Klotho signalizacija zavira ledvično reabsorpcijo fosfata. Pri kronični ledvični bolezni je izražanje Klotho v ledvičnih tubulih zmanjšano [39]. Poleg tega je dieta, bogata s fosfati, poslabšala pomanjkanje aKlotho v modelu ishemično-reperfuzijske akutne poškodbe ledvic in dodatno spodbudila povečanoledvicatkivna fibroza, ki pospešuje napredovanje kronične ledvične bolezni [18]. Vpliv fosfatne diete na ledvično izražanje Klotho je bil dokazan že na mišjih modelih [40]. Možno je, da med drugimi potmi preobremenitev s fosfati poslabša ledvično delovanje z modulacijo ekspresije Klotho na tubularnih celicah; to bi bilo treba nadalje raziskati v prihodnjih študijah.
Apoptozo in fibrozo posredujejo citokini, kot je TGF- [41, 42]. Opisali smo povezavo sekundarnega hiperparatiroidizma in posledično večjo ekspresijo TGF na proces preoblikovanja srca [43]. Domnevno obstaja povezava med aktivacijo PTH in signaliziranjem TGF, ki stimulira proliferacijo fibroblastov, sintezo kolagena in fibrozo. Obstajajo celo eksperimentalni dokazi o integriranem delovanju receptorjev TGF in PTH na kostne celice, ki uravnavajo signalizacijo preoblikovanja kosti [44]. Vloga signalizacije TGF-/Smad priledvicabolezen je že opisana. TGF- veže transmembranski receptor, sproži fosforilacijo proteinov Smads in spodbuja njihovo translokacijo v jedro za transkripcijske učinke. Zato so bistveni za prenos signala članov družine TGF. Pravzaprav je bila čezmerna ekspresija proteinov Smad2 in Smad3 v fibrotični ledvici na živalskih modelih s kronično ledvično boleznijo že dokazana [45]. Zanimivo je, da obstajajo dokazi o aktivaciji Smads z drugimi mediatorji, neodvisnimi od TGF-, kot so napredni končni produkti glikacije [46] in angiotenzin II [47]. Ker nadomeščanje PTH v eksperimentalnem modelu [11] ni vplivalo na učinek hiperfosfatemije na napredovanje kronične ledvične bolezni, se sprašujemo, ali bi imel fosfat neposredno vlogo pri signalizaciji Smad ledvic. V našem modelu ni bilo vpliva hiperfosfatemije na izražanje p-Smad v celicah ledvičnih tubulov.
Vendar to ne izključuje možnosti aktivacije poti TGF neodvisno od fosforilacije Smads. Za raziskovanje te alternativne poti so potrebne nadaljnje študije.
Pri vrednotenju kostnega tkiva je preobremenitev s fosfati povzročila apoptozo osteoblastom podobnih celic [22]. Rojas et al. je v kostnih biopsijah presajenih bolnikov dokazal, da je bilo število apoptotičnih celic večje pri tistih z nizko vsebnostjo fosfata in bi PTH vplival na povečanje osteoblastov in preprečevanje apoptoze [48]. Ta zaviralni učinek PTH na apoptozo kostnih celic je bil že dokazan [49]. Poleg učinkov na kostno tkivo so apoptotične poti povezane tudi z akutno odpovedjo ledvic [48] in bi lahko bile možen posrednik pri napredovanju kronične ledvične bolezni. V našem modelu smo opazili večji delež celic, ki so bile podvržene apoptozi v skupini LoP, brez statističnega pomena. Ti premisleki kažejo na oslabljen mehanizem apoptoze, ki ga povzroča hiperfosfatemija. Vendar moramo upoštevati, da ni bilo mogoče oceniti izključnega učinka fosfata naledvicatkivna apoptoza, ko se tudi pri živalih razvije zvišanje PTH in FGF-23.
V trenutni študiji smo obravnavali še en možen mehanizem ledvične okvare zaradi diete z visoko vsebnostjo fosfatov, disfunkcijo avtofagije, z merjenjem beljakovine beclin-1, regulativne beljakovine, potrebne za nukleacijo avtofagosomske membrane [50]. Avtofagija je katabolična pot, ki vključuje razgradnjo celičnih komponent skozi lizosome [51, 52]. Fosforilacija Beclin-1 je veljala za avtofagijsko specifičen signal za aktivacijo kompleksa fosfatidilinozitol-3-fosfat kinaze in rekrutiranje na membranska mesta biogeneze avtofagosoma [53]. Zrušitev beclina-1 zavira avtofagijo [54], ishemija-reperfuzija pa poveča njegove ravni [55]. Zmanjšanje beklina- 1 in sočasna regulacija mTOR zmanjšata rast malignih celic, kar poudarja učinek avtofagije na preživetje [52].
Antifibrotični učinki zdravila Klotho so bili povezani tudi s povečanim procesom avtofagije, potjo, skozi katero je bila ishemična poškodba oslabljena v modelu AKI in oslabljena zaradi visokih ravni fosfata [18]. Eksperimentalne študije so pokazale, da avtofagni tok ublaži infiltracijo makrofagov in s fosfati povzročeno ledvično fibrozo. Poleg tega okolje, bogato s fosfati, povzroči mitofagijo v tubularnih celicah in vitro [56]. Naši podatki so pokazali, da je vsebnost fosfata v prehrani modulirala tudi izražanje beklina-1 v ledvičnih tubulih in vivo. Dieta HiP je bila povezana tudi z večjo celično proliferacijo in trendom k nižji stopnji apoptoze, kot je prikazano z analizo PCNA oziroma TUNEL. Vendar pa v našem modelu ni bilo mogoče ugotoviti, ali se je to zgodilo kot neposreden učinek preobremenitve s fosfati ali zaradi nenormalnosti ravni PTH in FGF-23, ki jih povzroča hiperfosfatemija. To ugotovitev je treba potrditi v kliničnem scenariju.
Ključna prednost te študije je bila ocena vpliva omejitve fosfatov v dieti z nizko vsebnostjo beljakovin na napredovanje kronične ledvične bolezni, kar je vključevalo raziskavo njenega vpliva na histološke vzorce in molekularne fenotipeledvicatkivo. Kolikor vemo, je to prva študija, ki je pokazala modulacijo ekspresije beclin-1, označevalca avtofagije na celicah ledvičnih tubulov, s fosfatno dieto in vivo. Glavna omejitev je bila nezmožnost ločevanja učinka hiperfosfatemije od drugih nepravilnosti, povezanih s CKD-MBD, kot je zvišanje PTH in FGF-23. Prav tako nismo mogli ovrednotiti prehrane z vmesno vsebnostjo fosfatov ali ledvičnim izražanjem Klotho. Vendar pa naš model reproducira stanje v resničnem življenju, kjer je dieta HiP običajno povezana s hiperparatiroidizmom in visokimi ravnmi FGF-23.
4. Sklepi
Če povzamemo, ta študija je zagotovila dokaze, da ima fosfatna dieta vlogo pri napredovanju kronične ledvične bolezni, kar lahko poveča intersticijsko fibrozo. Poleg tega lahko prehrana, bogata s fosfati, spremeniledvicaproces avtofagije. Identifikacija od beljakovin neodvisne poti, po kateri fosfat poslabša ledvično delovanje, lahko odpre pomembno pot za razvoj novih pristopov, namenjenih preprečevanju ali zmanjšanju napredovanja kronične ledvične bolezni v kliničnem okolju.
5. Materiali in metode
V to študijo so bili vključeni odrasli samci podgan Munich-Wistar, pridobljeni iz lokalnega obrata. Podgane so vzdrževali pri 23 ± 1 ◦C, z zračno vlažnostjo 60 ± 5 odstotkov, v 12:12--urnem ciklu svetlo-temno. Vse živali so imele prost dostop do vode iz pipe in so bile hranjene z dieto z nizko vsebnostjo beljakovin (12 odstotkov beljakovin). Živali so žrtvovali dva meseca kasneje, ko so analizirali kri, urin in ledvično tkivo. Pri vseh podganah so določili tlak v manšeti repa, očistek kreatinina in dnevno izločanje albumina v urinu. Načrt poskusa je prikazan v dodatku A (slika A1).
5.1. Analitične tehnike
Šestdeset dni po Nx so živali anestezirali z natrijevim tiopentalom (50 mg/kg telesne mase) in zbrali vzorce krvi. Koncentracijo kreatinina v serumu smo ocenili s kolorimetrično metodo. Serumski albumin, fosfat, sečnina, kalcij in hematokrit so bili izmerjeni s standardnimi metodami. PTH je bil izmerjen z ELISA (Immutopics, San Clemente, CA, ZDA). FGF-23 smo izmerili s kompletom ELISA (KAINOS, Japonska) v skladu s protokolom proizvajalca. Izračunali smo glomerularno filtracijo z očistkom kreatinina na podlagi ravni kreatinina v serumu in urinu in izraženo v ml/min, izračunano s formulo: kreatinin v urinu (mg/dL) × urinski kolega (mL/min)/serumski kreatinin (mg/dL). Albumin v urinu smo določili z radialno imunodifuzijo.
-tretjine leveledvicaz zaprtjem dveh ali treh vej leve ledvične arterije. Lažno operirane podgane so bile podvržene anesteziji in manipulaciji ledvičnih pecljev brez zmanjšanja ledvične mase. Po okrevanju od anestezije so bile živali vrnjene v prvotne kletke, ki so bile ogrete v naslednjih 24 urah.
Frakcijsko izločanje fosfata (FEP) je bilo pridobljeno z urinom in serumskim fosfatom (mg/dl), urinom in serumskim kreatininom (mg/dl) in izraženo v odstotkih z naslednjo formulo: (urin/serumski fosfat)/ (urin/serum kreatinina) × 100.
5.2. Eksperimentalne skupine
Živali so bile razdeljene v dve skupini glede na vsebnost fosfatov v prehrani, kot je določeno spodaj: dieta z nizko vsebnostjo fosfatov (LoP): n=20; živali so prejele TD-90016, 12-odstotno beljakovinsko dieto, prirejeno za 0.2-odstotno koncentracijo fosfata. Dieta z visoko vsebnostjo fosfatov (HiP): n=19; živali so prejemale TD-90016, 12-odstotno beljakovinsko dieto, spremenjeno za 0.95-odstotno koncentracijo fosfata.
5.3. Histološke tehnike
Ostanekledvicaje bil perfundiran in situ pri opazovanem MAP s fiziološko raztopino in nato z raztopino Duboscq-Brasil za fiksacijo. Po tehtanju sta bili dve srednjekoronalni ledvični rezini postfiksirani v pufriranem 4-odstotnem formaldehidu. Ledvično tkivo je bilo nato vstavljeno v parafin in pripravljeno za histomorfometrijo in imunohistokemijo, kot je opisano prej [57].
Vse morfometrične ocene je v odsekih debeline 4- µm izvedel en sam opazovalec, ki je zaslepil skupine. Za vsako podgano je bila ocenjena resnost glomeruloskleroze (GS) v odsekih, obarvanih s periodno kislino Schiff (PAS), tako da se je vsakemu glomerulu (preiskanih je bilo najmanj 120 na podgano) ocena za oceno skleroziranega deleža območja čopkov. in izpeljava indeksa GS (GSI) za vsako podgano, kot je opisano prej [58]. Za oceno stopnje intersticijske ekspanzije je bil delež kortikalne ledvične površine, ki jo zaseda intersticijska fibroza (odstotek IF), ocenjen v odsekih, obarvanih po Massonu, s tehniko štetja točk [59].
5.4. Imunohistokemija
Štiri µm debele, v parafin vdelane ledvične sekcije so bile nameščene na stekelcih, prevlečenih s 6 odstotki silana. Sekcije so bile deparafinizirane, rehidrirane in nato segrete v citratnem pufru, da se poveča pridobivanje antigena. Predinkubirali so jih s 5-odstotnim normalnim kunčjim (za ED-1) ali konjskim (za -aktin) serumom v tris-pufrirani fiziološki raztopini (TBS) ali raztopini proteinskega bloka na osnovi kazeina (protein blok; DAKO Corporation, Santa Clara, CA, ZDA (za PCNA, pSmad in Beclin)), da se prepreči nespecifična vezava. Inkubacija s primarnim protitelesom je potekala čez noč pri 4 ◦C. Negativne kontrole so bile izvedene z izpustitvijo primarnega protitelesa.
Uporabljena so bila naslednja primarna protitelesa: monoklonsko mišje protitelo proti podganji ED-1 (Serotec, Oxford, UK), za odkrivanje makrofagov; mišje monoklonsko anti-alfa gladko (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, ZDA), za odkrivanje -aktina; poliklonsko protitelo proti Beclin 1 (Boster, Pleasanton, CA, ZDA), za analizo avtofagije. Po izpiranju so rezine 45 minut inkubirali z biotiniliranim protimišjim IgG (H plus L), (Vector, Burlingame, CA, ZDA), čemur je sledil komplet VECTASTAIN® ABC-AP, Vector® Red (Vector, Burlingame, CA). , ZDA) 30 min. Odrezke smo nato razvili z raztopino hitro rdečega barvila.
Za monoklonski mišji antiproliferacijski celični jedrski antigen (Dako, Danska) in protitelo fosfor-smad2 (Ser465/467) (Cell Signaling, Danvers, MA, ZDA) je bila endogena inhibicija peroksidaze izvedena s 3-odstotno raztopino vodikovega peroksida in metanolom 30 min. Odseke smo nato čez noč inkubirali s primarnim protitelesom v vlažni komori pri 4 ◦C. Naslednji dan smo odseke 45 minut inkubirali z biotiniliranim protimišjim IgG (H plus L) ali biotiniliranim protipodganjim IgG (H plus L) (Vector, Burlingame, CA, ZDA), čemur je sledila inkubacija z VECTASTAIN® ABC- HRP komplet (Vector, Burlingame, CA, ZDA) za 30 min. Sekcije so bile nato razvite z uporabo 3-amino-9-etilkarbazolnega substrata kromogena (AEC) (Sigma Chemical, St. Louis, MO, ZDA). Vse odseke smo splaknili z destilirano vodo, kontrastno obarvali z Mayerjevo raztopino hemaluma (Merck, Darmstadt, Nemčija), prekrito s Kaiserjevo glicerinsko želatino (Merck, Darmstadt, Nemčija).
Za oceno intersticijske ledvične gostote ED-1, p-Smad, Beclin in PCNA je bilo število pozitivnih celic/mm2 ocenjeno na slep način pri 400-kratni povečavi. Za ovrednotenje -aktina smo uporabili tehniko štetja točk z uporabo mikroskopa s 100-točkovnim okularjem, povezanim z video monitorjem. Analizirali smo 25 polj pod 3200-kratno povečavo. Rezultati so bili izraženi v odstotkih glede na celotno površino.
5.5. Apoptoza
Apoptozo smo določili v ledvičnih tubularnih celicah s tehniko TUNEL (TdT posredovano X-dUTP Nick end marking) z uporabo navodil, ki jih je zagotovil Apoptag plusPeroxidase in Situ Apoptosis Detection Kit (S7101, Millipore Sigma, MA, ZDA). Apoptotične celice smo analizirali v 25 poljih, s povečavo 1000×, da smo dobili končno vrednost, izraženo v celicah/mm2.
5.6. Statistična analiza
Razlike med skupinama LoP in HiP so bile testirane z uporabo neodvisnega Studentovega testa ali Mann-Whitneyjevega testa. Odnose med spremenljivkami smo preverjali s Spearmanovim korelacijskim koeficientom. Podatki so predstavljeni kot povprečje ± SE, razen če ni navedeno drugače. P-vrednost<0.05 was="" considered="" significant.="" analyses="" were="" performed="" using="" ibm="" spss="" statistics,="" version="" 20.0.1="" (ibm="" corp.,="" armonk,="" ny,="" usa)="" and="" graphpad="" prism9.1.2="" statistical="" software="" (graphpad,="" san="" diego,="" ca,="">
Financiranje:To študijo je podprla Raziskovalna fundacija Sáo Paulo (FAPESP—dotacija št. 2010/05409-6). Moyses, Jorgetti, Zatz in Elias podpira CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnol6gico), vendar ta finančna podpora ni imela nobene vloge pri pisanju tega dokumenta.
Izjava institucionalnega revizijskega odbora:Ta študija je bila izvedena v skladu s priporočili lokalnega odbora za etično presojo. Protokol je odobril Comite detica em Pesquisa do Hospital das Clinicas da Faculdade de Medicina da USP (CEUA, postopek št. 090/10 in datum odobritve 10. avgust 2010). Vsi poskusni postopki so sledili strogim mednarodnim standardom za manipulacijo in oskrbo laboratorijskih živali.
Izjava o razpoložljivosti podatkov:Podatki, predstavljeni v tej študiji, so na voljo na zahtevo ustreznega avtorja.
Zahvala:Avtorji se zahvaljujejo Wagnerju Dominguezu za njegovo strokovno tehnično pomoč. Navzkrižje interesov: Avtorji izjavljajo, da ni navzkrižja interesov.
Reference
1. Hill, NR; Fatoba, ST; Oke, JL; Hirst, JA; O'Callaghan, CA; Lasserson, DS; Hobbs, FD Globalna razširjenost kroničneledvicabolezen – sistematični pregled in metaanaliza. PLoS ONE 2016, 11, e0158765.
2. Wen, CP; Chang, CH; Tsai, MK; Lee, JH; Lu, PJ; Tsai, SP; Wen, C.; Chen, CH; Kao, CW; Tsao, CK; et al. Sladkorna bolezen z zgodnjoledvicavpletenost lahko skrajša pričakovano življenjsko dobo za 16 let. Kidney Int. 2017, 92, 388–396.
3. Kakinuma, Y.; Kawamura, T.; Bills, T.; Yoshioka, T.; Ichikawa, I.; Fogo, A. Od krvnega tlaka neodvisen učinek inhibicije angiotenzina na vaskularne lezije kronične odpovedi ledvic.LedvicaInt. 1992, 42, 46–55.
4. Fried, LF; Orchard, TJ; Kasiske, BL Učinek zmanjšanja lipidov na napredovanje ledvične bolezni: meta-analiza.LedvicaInt. 2001, 59, 260–269.
5. Ishidoya, S.; Morrissey, J.; McCracken, R.; Reyes, A.; Klahr, S. Antagonist receptorjev angiotenzina II izboljša ledvično tubulointersticijsko fibrozo, ki jo povzroča enostranska obstrukcija sečnice.LedvicaInt. 1995, 47, 1285–1294.
6. Audigier, JC; Kanjanbuch, T.; Ma, LJ; Brown, NJ; Fogo, AB Regresija obstoječe glomeruloskleroze z zaviranjem aldosterona. J. Am. Soc. Nefrol. 2005, 16, 3306–3314.
7. Nath, KA; Kren, SM; Hostetter, TH Omejitev prehranskih beljakovin pri ugotovljeni ledvični poškodbi pri podganah. Selektivna vloga glomerularnega kapilarnega tlaka pri progresivni glomerulni disfunkciji. J. Clin. Raziskati. 1986, 78, 1199–1205.
8. Brenner, BM; Meyer, TW; Hostetter, TH Prehranski vnos beljakovin in progresivna naravaledvicabolezen: Vloga hemodinamsko posredovane glomerulne poškodbe v patogenezi progresivne glomerularne skleroze pri staranju, ablaciji ledvic in intrinzični ledvični bolezni. N. angl. J. Med. 1982, 307, 652–659.
9. Bellizzi, V. Dieta z nizko vsebnostjo beljakovin ali prehranska terapija pri kroničniledvicabolezen? Čiščenje krvi. 2013, 36, 41–46.
10. Kusano, K.; Segawa, H.; Ohnishi, R.; Fukušima, N.; Miyamoto, K. Vloga diete z nizko vsebnostjo beljakovin in fosforja pri napredovanju kroničneledvicabolezen pri uremičnih podganah. J. Nutr. Sci. Vitam. 2008, 54, 237–243.
11. Neves, KR; Graciolli, FG; dos Reis, LM; Pasqualucci, CA; Moyses, RM; Jorgetti, V. Škodljivi učinki hiperfosfatemije na hipertrofijo miokarda, delovanje ledvic in kosti pri podganah z odpovedjo ledvic.LedvicaInt. 2004, 66, 2237–2244. [CrossRef] [PubMed]
12. Finch, JL; Lee, DH; Liapis, H.; Ritter, C.; Zhang, S.; Suarez, E.; Ferder, L.; Slatopolsky, E. Omejitev fosfatov znatno zmanjša umrljivost pri uremičnih podganah z ugotovljeno vaskularno kalcifikacijo. Kidney Int. 2013, 84, 1145–1153.
13. Cupisti, A.; Blasco, P.; D'Alessandro, C.; Giannese, D.; Sabatino, A.; Fiaccadori, E. Zaščita preostale ledvične funkcije in prehransko zdravljenje: strategija prvega koraka za zmanjšanje uremičnih toksinov pri bolnikih s končno ledvično boleznijo. Toksini 2021, 13, 289.
14. Yan, B.; Su, X.; Xu, B.; Qiao, X.; Wang, L. Vpliv omejitve prehranskih beljakovin na napredovanje kroničneledvicabolezen: sistematični pregled in metaanaliza. PLoS ONE 2018, 13, e0206134. [CrossRef] [PubMed]
15. Klahr, S.; Levey, AS; Beck, GJ; Caggiula, AW; Hunsicker, L.; Kusek, JW; Striker, G. Učinki omejevanja prehranskih beljakovin in nadzora krvnega tlaka na napredovanje kronične ledvične bolezni. Sprememba prehrane v študijski skupini za ledvično bolezen. N. angl.
J. Med. 1994, 330, 877–884. [CrossRef]
16. Hu, MC; Ši, M.; Cho, HJ; Adams-Huet, B.; Paek, J.; Hill, K.; Shelton, J.; Amaral, AP; Faul, C.; Taniguchi, M.; et al. Kloto in fosfat sta modulatorja patološkega uremičnega preoblikovanja srca. J. Am. Soc. Nefrol. 2015, 26, 1290–1302.
17. Hu, MC; Ši, M.; Cho, HJ; Zhang, J.; Pavlenco, A.; Liu, S.; Sidhu, S.; Huang, LJ; Moe, OW Receptor za eritropoetin je nadaljnji efektor citoprotekcije, ki jo povzroča Klotho. Kidney Int. 2013, 84, 468–481.
18. Ši, M.; Flores, B.; Gillings, N.; Bian, A.; Cho, HJ; Yan, S.; Liu, Y.; Levine, B.; Moe, OW; Hu, MC alphaKlotho ublaži napredovanje AKI v KLB z aktivacijo avtofagije. J. Am. Soc. Nefrol. 2016, 27, 2331–2345.
19. Ding, Y.; Kim, S.; Lee, SY; Koo, JK; Wang, Z.; Choi, ME Avtofagija uravnava izražanje TGF-beta in zaviraledvicafibroza, ki jo povzroči enostranska obstrukcija sečnice. J. Am. Soc. Nefrol. 2014, 25, 2835–2846.
20. Mustakas, A.; Souchelnytskyi, S.; Heldin, CH Regulacija Smad v transdukciji signala TGF-beta. J. Cell Sci. 2001, 114, 4359–4369.