Terapevtski učinek in mehanizem feniletanolnih glikozidov Cistanche na s ciklofosfamidom povzročeno spermatogenezo pri miših
Mar 11, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com
ZHAODong-hai1, ZHANGLei2, ZHANGYan3, QILing1, ZOU Xiang-ming4
[Povzetek]
Namen:Za raziskovanje terapevtskega učinkaCistanche feniletanoidni glikozidina miših s ciklofosfamidom inducirano spermatogenezo in za predhodno razjasnitev njegovega mehanizma delovanja.metoda:Metoda ekstrakcije etanola za ekstrakcijoCistanche feniletanoidni glikozidi. Štirideset miši BALB/C je bilo naključno razdeljenih v kontrolno skupino, modelno skupino, nizkoodmernoCistanche feniletanoidni glikozidskupina (50 mg·kg-1) in skupina z visokim odmerkom (100 mg·kg-1), z 10 mišmi v vsaki skupini. Razen v kontrolni skupini so miši v drugih skupinah injicirali ciklofosfamid (80 mg·kg-1) vsak dan 5 zaporednih dni, da so pripravili mišje modele motenj spermatogeneze. Po zadnjem dajanju so miši v skupinah z nizkimi in visokimi odmerkiCistanche feniletanoidni glikozidiso dajali ustrezne odmerke z gavažo, miši v kontrolni skupini in modelni skupini pa so dobivale enako količino normalne fiziološke raztopine z gavažo, enkrat na dan 30 dni. Štiriindvajset ur po zadnji gavaži so vzeli tkivo mišjega testisa. Za določitev ravni testosterona v homogenatu mišjega testisnega tkiva smo uporabili encimski imunosorbentni test. Primerjali so gostoto semenčic, gibljivost semenčic in stopnjo nenormalnosti semenčic vsake skupine. Morfološke spremembe tkiva mod smo opazovali z barvanjem s HE. Rezultati: V primerjavi s kontrolno skupino sta se gostota semenčic in stopnja gibljivosti semenčic v modelni skupini zmanjšali (P<0.01), the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" increased=""><0.01), and="" the="" level="" of="" testosterone="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" decreased=""><0.01). 0.01);="" compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" sperm="" density="" and="" sperm="" motility="" of="" mice="" in="" each="" dose="" group="" of="">Cistanche feniletanoidni glikozidiso se znatno povečale (P<0.01), the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><0.01), and="" the="" testicular="" tissue="" the="" level="" of="" testosterone="" in="" the="" homogenate="" increased=""><0.05 or=""><0.01). histological="" observations="" showed="" that="" the="" seminiferous="" tubules="" in="" the="" testis="" of="" the="" model="" group="" were="" atrophied="" and="" degenerated,="" the="" seminiferous="" epithelium="" was="" significantly="" thinner,="" the="" arrangement="" of="" spermatogenic="" cells="" was="" disordered,="" and="" the="" number="" of="" sperm="" in="" the="" cavity="" decreased;="" the="" number="" of="" the="" seminiferous="" epithelium="" in="" the="" testes="" of="" the="">Cistanche feniletanoidni glikozidskupina se je znatno povečala, plasti so razločne, spermatogene celice so razporejene lepo, tesno in enakomerno, v lumnu pa je mogoče videti semenčice.Zaključek: Cistanche feniletanoidni glikozidiima pomemben terapevtski učinek na motnjo spermatogeneze, ki jo povzroča ciklofosfamid pri miših, njegov mehanizem pa je lahko povezan z izboljšanjem ravni testosterona v tkivih testisov.
[Ključne besede]Cistanche feniletanoidni glikozidi; ciklofosfamid; motnje spermatogeneze; miši, BALB/C
Zaradi pospešenega družbenega ritma, slabih življenjskih navad in onesnaženosti okolja ter drugih dejavnikov je nenormalna kakovost sperme, kot sta oligospermija in astenospermija, postala glavni vzrok za moško neplodnost [1]. Trenutno je manj zdravil za zdravljenje oligospermije in astenospermije, terapevtski učinek pa ni očiten. Recepti tradicionalne kitajske medicine ali učinkovine dobro vplivajo na izboljšanje reproduktivne funkcije moških [2-6]. Vendar pa zaradi široke palete zdravil na recept razmerje med farmakološkimi učinki in učinkovitimi sestavinami zdravila ni jasno, kar omejuje promocijo in uporabo spermatogenih zdravil. Raziskave in razvoj učinkovitih sestavin kitajske medicine ter preučevanje njenih terapevtskih učinkov pri reproduktivnih poškodbah imajo dobro uporabno vrednost.Cistanche feniletanoidni glikozidiso ena najpomembnejših učinkovin vCistanche deserticola. Običajno so naravni glikozidi, ki vsebujejo estrske vezi in okso-glikozidne vezi z -glukozo kot jedrom. Veliko jih najdemo v dvokaličnicah [7]. Študije [8] so pokazale, daCistanchefeniletanoidglikozidilahko zaščiti spermo podgan pred oksidativnimi poškodbami in vitro, vendar ni poročil o njegovi spermatogenezi. Ta poskus preučuje terapevtski učinek feniletanoidnih glikozidov Cistanche na spermatogeno funkcijo miši s ciklofosfamidom inducirano spermatogenezo in zagotavlja eksperimentalno in teoretično podlago za uporaboCistanche feniletanoidni glikozidipri zdravljenju motenj spermatogeneze.
1. Materiali in metode
1.1. Laboratorijske živali, glavni reagenti in instrumenti
40 odraslih miši BALB/C razreda SPF, starih 6-8 tednov, s telesno maso 20-22g, je bilo kupljenih v Animal Experimental Center School of Basic Medicine Univerze Jilin in številka potrdila o živalih : SCXK (Kirgizistan) 2008-005. Miši so bile prilagojeno vzrejene 5 dni pred poskusom. Pogoji hranjenja: 22 stopinj ~ 25 stopinj, cirkadiani ritem (12h/12h), brezplačna pitna voda in hrana. Cistanche je izdelek Xinjiang Dakang Trading Company. Ciklofosfamid za injiciranje je bil kupljen pri Jiangsu Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. (številka serije 11061921). Komplet za encimski imunski test homogenata testisnega tkiva je bil kupljen pri Tianjin Jiuding Medical Bioengineering Co., Ltd. (številka serije) 20120812), vsi drugi reagenti so analitske stopnje domače proizvodnje. Čitalnik mikroplošč PLUS384 (MDC v Združenih državah), invertni mikroskop TE2000U (Nikon, Japonska) in centrifuga J-26XP (Nanodrop, Združene države).
1.2 Priprava Cistanche Phenylethanol Glucoside
10 g praška cistanche smo ekstrahirali z refluksom s 70-odstotnim etanolom, dvakrat po 2 uri, da smo dobili koncentrat glikozida fenetilnega alkohola. Koncentrirano raztopino kromatografiramo na koloni z makroporozno smolo D101 in eluiramo s 70-odstotnim etanolom, da dobimo fenekozidni alkohol Cistanche. UV spektrofotometer je ekstrakt identificiral pri valovni dolžini 333 nm.
1.3 Priprava živalskega modela in način dajanja zdravila
Potem ko je bilo 40 samcev miši BALB/C prilagojeno hranjenih 5 dni, so miši naključno razdelili v 4 skupine (10 miši v vsaki skupini): kontrolna skupina, modelna skupina, CistancheCistanche feniletanoidni glikozidiskupino z nizkimi odmerki inCistanche feniletanoidni glikozidiskupina z visokimi odmerki. Razen kontrolne skupine so ostale tri skupine miši dobile intraperitonealno injekcijo ciklofosfamida 80 mg·kg-1 za vsako miško 5 zaporednih dni, da so pripravili živalske modele motenj spermatogeneze. Ko je bil model pripravljen, so miši v skupinah z nizkimi in visokimi odmerkiCistanchefeniletanoid so prejeli 50 oziroma 100 mg·kg-1·d-1. Miši v kontrolni skupini in modelni skupini so dobile enake količine normalne fiziološke raztopine. Enkrat na dan 30 dni. Vse miši so žrtvovali 24 ur po zadnjem dajanju zdravila in opravili dvostranske teste. Desni testis je bil fiksiran s formaldehidom. Epididimis in testis so vzeli z leve strani. Testis smo homogenizirali in centrifugirali pri 3,000 min 10 min. Supernatant je bil vzet in shranjen v zamrzovalniku pri -20 stopinjah za testiranje. Levi epididimis je bil testiran na gostoto semenčic, gibljivost semenčic in stopnjo deformacije.
1.4 Določanje gostote semenčic, gibljivosti semenčic in stopnje deformacije
Postavite epruveto z 10 ml hranilne raztopine sperme [9] v vodno kopel s konstantno temperaturo, da jo segrejete na 37 stopinj, vzemite enostranski epididimis, da odstranite vezivno tkivo in maščobo, odrežite tkivo in ga dajte v epruveto pri 37 stopinj 10 minut. Ko se sperma popolnoma sprosti, vzemite 1 kapljico na ploščo za štetje krvnih celic in izračunajte gostoto sperme v skladu z metodo štetja celic. Rezultat je izražen kot število semenčic na mililiter; poleg tega iz epruvete odvzamemo 5 μL suspenzije semenčic in enako količino eozina-Y. Dobro premešamo, postavimo na sobno temperaturo za 10 minut, dodamo pokrovno steklo in opazujemo s svetlobnim mikroskopom. Mrtve semenčice so obarvane rožnato, žive semenčice niso obarvane in citoplazma je prozorna. Vsak vzorec prešteje 200 semenčic, izračuna viabilnost semenčic, rezultat je izražen v odstotkih, viabilnost semenčic=število živih semenčic / skupno število semenčic × 100 odstotkov. Drugih 5 μL suspenzije sperme smo 5 minut fiksirali v metanolu, posušili in 1 uro obarvali z 2-odstotno vodno raztopino eozina, splaknili in posušili s fenom. Poiščite dele z manj prekrivanjem semenčic pod lečo z nizko svetlobo in uporabite lečo z visoko svetlobo, da preverite pravilnost morfologije semenčic. Vsaka miška je pregledala 1000 celotno spermo. Glavice semenčic brez kavljev, bananaste oblike, amorfne, debele glave in dvojne glave so bile ocenjene kot deformacije. Izračunali smo stopnjo deformacije semenčic in rezultate izrazili v odstotkih. Stopnja deformacije semenčic=število deformiranih semenčic / skupno število semenčic × 100 odstotkov.
1.5 Določanje reproduktivnih hormonov
Testis smo olupili z membrane in ga dali v posodo za vialo ter predhodno ohlajen homogenizacijski medij (0.01mol·L-1 saharoza, 0.01mol ·L-1 Tris-HCl, 0,1 mmol·L-1 raztopine EDTA-Na2, pH 7,4), z oftalmološkimi škarjami prerežemo tkivo testisa, ga vlijemo v stekleno homogenizacijsko epruveto in centrifugiramo pri 4, 000×g 10 minut pri nizki temperaturi in vzemite supernatant. Uporabite komplet za encimski imunosorbentni test za merjenje ravni testosterona v homogenatu testisnega tkiva in testirajte 3 vzporedne vzorce za vsak vzorec. Eksperimentalni koraki in metode so bili dokončani v skladu z navodili kompleta.
1.6 Morfološko opazovanje testisa
Vzemite parafinske reze mišjega testisa, obarvane z HE, in pod svetlobnim mikroskopom opazujte porazdelitev spermatogonijev in spermatogenih celic v tkivu testisa.
1.7 Statistična analiza
Statistična analiza je bila izvedena s statistično programsko opremo SPSS17.0. Gostota semenčic, stopnja gibljivosti semenčic, stopnja deformacije semenčic in raven testosterona v testisih miši v vsaki skupini so bili izraženi kot x±s, primerjava med skupinami pa je bila izvedena z enofaktorsko analizo variance.
2. rezultati
2.1. Gostota semenčic, gibljivost semenčic in stopnja deformacije semenčic vsake skupine miši
V primerjavi s kontrolno skupino sta se gostota sperme in sposobnost preživetja sperme v modelni skupini zmanjšali (P<0.01), and="" the="" sperm="" deformity="" rate="" increased=""><0.01). compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" sperm="" density="" and="" sperm="" motility="" rate="" of="" mice="" in="" each="" dose="" of="">Cistanche fenoksietanol glikozidpovečana (P<0.05 or=""><0.01), and="" the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><0.05 and=""><0). .01).="" compared="" with="" the="" low-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group,="" the="" high-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group="" had="" higher="" sperm="" density="" and="" sperm="" motility=""><0.05), and="" the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><0.05). see="" table="">
2.2 Ravni testosterona v tkivih testisov miši v vsaki skupini
Ravni testosterona v homogenatih testisnega tkiva kontrolne in modelne skupine so bile (10.26±0.57) in (5,33±0.84) nmol·L-1, oz. Raven testosterona v modelni skupini je bila bistveno nižja kot v kontrolni skupini (P<0.01). the="" testosterone="" levels="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" of="" the="" low-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group="" were="" (7.55±1.21)="" and="" (10.35±0.94)="" nmol·l-1.="" the="" level="" of="" testosterone="" in="" the="" low="" and="" high-dose="" groups="" of="" cistanche="" cistanche="" ethanol="" glycosides="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" of="" the="" model="" group=""><0.05 or=""><0.01). the="" testosterone="" level="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" of="" the="">Cistancheskupina z velikimi odmerki fenetil glikozida cistanche je bila znatno višja kot v skupini z nizkimi odmerki (P<>
2.3 Morfologija testisov miši v vsaki skupini
Opazovano s svetlobnim mikroskopom so bili semenski tubuli v testisih normalne skupine gosto razporejeni, raven in število zarodnih celic sta bila velika, semenski epitelij je bil lepo urejen in vsi semenski tubuli so bili vidni s tvorbo semenčic. V modelni skupini so bili semenski tubuli v testisih miši atrofirani in degenerirani, semenski epitelij je bil znatno stanjšan, število epitelijskih plasti zmanjšano, razporeditev je bila neurejena in število semenčic v votlini je bilo zmanjšano. V primerjavi z modelno skupino je nizek odmerekCistanche fenetil alkoholni glikozid.
V skupini se je povečalo število semenskih epitelijskih plasti semenskih tubulov, razporeditev epitelija je bila bolj pravilna, poškodbe semenskih tubulov pa so se očitno izboljšale; struktura semenskih tubulov pri visokih odmerkihCistanche feniletanoidni glikozidskupini se je občutneje izboljšalo, število in število plasti semenskega epitelija pa sta se znatno povečala. V semenskih tubulih so zrele sperme, če so lepo razporejene, struktura pa je v bistvu spet normalna. Glej sliko 1 (vložek 6).
3 Razprava
Ciklofosfamid je pogosto uporabljeno protitumorsko zdravilo in imunosupresiv, ki v glavnem posega v različne znotrajcelične biološke funkcije z alkilacijo DNA. Reproduktivna toksičnost je eden od glavnih stranskih učinkov ciklofosfamida [3], ki lahko zlahka povzroči poškodbe DNK semenčic in nenormalen razvoj semenčic. Klinične študije [10-11] kažejo, da lahko reproduktivna toksičnost ciklofosfamida povzroči azoospermijo ali oligospermijo. , ki vodi do neplodnosti ali pojava genetskih okvar ali malformacij pri potomcih.
Cistanche tubulosaje večletna višja parazitska rastlina iz družine Leiden. Je znano kitajsko zdravilo, ki neguje ledvice in jang, neguje kri, neguje črevesje. Je pogosto uporabljeno zdravilo na recept za tradicionalno zdravljenje moške reproduktivne disfunkcije [12].Feniletanoidni glikozidiso ena najpomembnejših aktivnih sestavinCistanche[13] in imajo širok razpon farmakoloških učinkov, kot so antioksidacija, zaviranje staranja in proti tumorjem [14].
V tej študiji je bil ciklofosfamid uporabljen za pripravo mišjega modela motnje spermatogeneze in proučen je bil terapevtski učinek feniletanoidnih glikozidov Cistanche na motnjo spermatogeneze, ki jo povzroča ciklofosfamid. Rezultati so pokazali, da se je v primerjavi z normalno skupino gostota semenčic modelne skupine zmanjšala, stopnja preživetja zmanjšala in stopnja deformacij povečala. V primerjavi z modelno skupino lahko vse skupine odmerkov fenoksietanolnih glikozidov Cistanche učinkovito povečajo gostoto semenčic, povečajo gibljivost semenčic in zmanjšajo stopnjo deformacije semenčic. Zgornji rezultati kažejo, da lahko cistančni fenoksietanol glikozidi spodbujajo spermatogenezo in zaščitijo poškodovana moda. Rezultati morfologije mod so pokazali, da po zdravljenju zCistanche feniletanoidni glikozid, je bilo število semenskega epitelija v testisih modelnih miši znatno povečano, plasti so bile razločne, spermatogene celice so bile razporejene lepo, tesno in enakomerno, spermo pa je mogoče videti v lumnu, kar nakazuje, daCistanche phenylethanoidlahko spremeni Shanhe obnovi strukturo in morfologijo semenskega epitelija po reproduktivni poškodbi.
Testosteron uravnava diferenciacijo moških zarodnih celic in je nujen pogoj za normalen razvoj mod in normalen nastanek semenčic. Nekatere študije [15] so poročale, da je selektivni izpad androgenih receptorjev v Sertolijevih celicah testisa povzročil motnje v razvoju sperme in moško sterilnost. V tej študiji je bil ciklofosfamid uporabljen za proizvodnjo spermatogenih snovi.
Po modelu poškodbe zaradi ovire je bila raven testosterona v tkivu testisov miši znatno nižja kot v normalni skupini. Po delovanju feniletanoidnih glikozidov Cistanche se je raven testosterona v vsaki skupini zvišala, raven testosterona v skupini z visokimi odmerki pa je bila znatno višja kot v skupini z nizkimi odmerki. Domneva se, da lahko cistančni fenoksietanol glikozidi spodbujajo spermatogenezo s povečanjem ravni testosterona v tkivu testisov za zdravljenje spermatogene disfunkcije, vendar mehanizem njegovega vpliva na testosteron potrebuje nadaljnje raziskave in razprave.
Testosteron uravnava diferenciacijo moških zarodnih celic in je nujen pogoj za normalen razvoj mod in normalen nastanek semenčic. Nekatere študije [15] so poročale, da je selektivni izpad androgenih receptorjev v Sertolijevih celicah testisa povzročil motnje v razvoju sperme in moško sterilnost. V tej študiji je bil ciklofosfamid uporabljen za proizvodnjo spermatogenih snovi.
Po modelu poškodbe zaradi ovire je bila raven testosterona v tkivu testisov miši znatno nižja kot v normalni skupini. Po delovanjuCistanche feniletanoidni glikozidi, so se ravni testosterona v vsaki skupini z odmerki povečale, raven testosterona v skupini z visokimi odmerki pa je bila znatno višja kot v skupini z nizkimi odmerki. Domneva se, da lahko cistančni fenoksietanol glikozidi spodbujajo spermatogenezo s povečanjem ravni testosterona v tkivu testisov za zdravljenje spermatogene disfunkcije, vendar mehanizem njegovega vpliva na testosteron potrebuje nadaljnje raziskave in razprave.
[reference]
[1] Wang Yixin, Zheng Jufen. Nov napredek pri raziskavah moške neplodnosti [J]. Chinese Journal of Andrology, 2006, 12(9): 771-774.
[2] Xie Jianxing, Wang Jun, Chen Ming et al. Vpliv kapsule Guilingji na modelne podgane z oligospermijo. Vloga proizvodnje sperme in vpliv na spolne hormone [J]. Journal of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy, 2011, 28(6): 621-623.
[3] Zhang Changcheng, Jia Liangliang, Li Shouchao, et al. Epimedium skupni flavonoidi povzročajo minimizacijo ciklofosfamida Raziskave o zaščitnem učinku spermatozoidne pregrade, rojene pri podganah [J]. Kitajska patentna medicina, 2010, 32 (12): 2052-2055.
[4] Xu Lei, Wang Rui, Zhang Weixing et al. Granule Shengjing pri okvari sperme, ki jo povzroči ciklofosfamid, ovirajo terapevtski učinek miši [J]. Journal of Zhengzhou University: Medical Science Edition, 2008, 43(2): 267-270.
[5] Wang Rui, Xu Lei, Zhang Weixing et al. Vpliv zrnc kitajske medicine Shengjing na miši z oslabljeno spermatogenezo. Eksperimentalne raziskave o terapevtskih učinkih [J]. Chinese Journal of Andrology, 2008, 14 (11): 1046-1049.
[6] Guo Kaihua, Gao Fulu, Niu Siyun, et al. Učinek decokcije Heshouwu na tkivo testisov starajočih se podgan Vpliv celične poti prenosa signala Rb/p53 [J]. Anatomy Journal, 2010, 41(3): 435-439.
[7] Wu Haihong, Xuan Guodong, Liu Chunquan. Učinek refluksne ekstrakcije Cistanche Phenylethanol Glucoside z raziskavo faktorja etanola [J]. Jiangsu Agricultural Sciences, 2009 (1): 250-251.
[8] Li Gang, Zhu Wenbin, Niu Fei et al. Učinki Cistanche Phenylethanol Glucoside na Raziskava sperme podgan o zaščitnem učinku zunanjih oksidativnih poškodb [J]. Tradicionalna kitajska medicina Lishizhen in Materia Medica, 2010, 21(9): 2205-2207.
[9] Chen Deyu, Liu Limin, Xie Qingdong itd. Protitelesa proti semenu na mitohondrijsko funkcijo sperme Vpliv [J]. Journal of Shantou University Medical College, 2008, 21(1): 4-6.
[10] KenneyLB, Laufer MR, Grant FD, et al. Visoko tveganje za informacije Highdoseccyclophaphamiddeforsarcomaduringchildhood [J].Cancer, 2001, 91(3): 613-621.
[11] JahunkainenK, EhmckeJ, Houm, et al. Funkcija testisov in ohranjanje plodnosti pri bolnikih z rakom [J]. BestPrect ResClinEndocrinol Metab, 2011, 25: 287-302.
[12] Gao Zhanyou, Zhou Haitao, Lin Qiang. Sposobnost Cistanche, da se upre utrujenosti pri vadbi pri podganah in vplivu prostih radikalov v možganih [J]. Anhui Agricultural Sciences, 2011, 39(16): 9592-9595.
[13] Ren Lu, Gu Xiaohong, Tang Jian et al. Phenylethanol glicosides in cultivated Cistanche cistanche Ekstrakcija in raziskave čiščenja [D]. Wuxi: Univerza Jiangnan, 2006, 25(3): 33-36. [14] Jinghui, Zuo Jianfeng, Li Jiaoshe. Napredek v farmakoloških raziskavah fenoksietanolnih glikozidov Razstava [J]. Lishizhen Medicine in Materia Medica, 2006, 17(3): 440-441.
[15] ChangC, ChenYT, YehSD, et al. Infomedia spomladi TheandrogenreceptorinSertolicells [J]. ProcNatlAcadSci ZDA, 2004, 101 (18): 6876-6881.
