Skupni glikozidi Cistanche Deserticola spodbujajo okrevanje nevroloških funkcij z induciranjem nevrovaskularne regeneracije po poti Nrf- 2/Keap-1 pri podganah MCAO/R

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

Fujiang Wang, Ruiyan Li, Pengfei Tu, Jianping Chen, Kewu Zeng in Yong Jiang

Ozadje:Poročali so, da je tradicionalna kitajska medicina Cistanche deserticola učinkovita pri kardiovaskularnih in cerebrovaskularnih boleznih. Vendar njegove aktivne sestavine za zaščito pred ishemično možgansko kapjo niso jasne. Naš cilj je bil raziskati aktivne sestavineC. deserticolaproti ishemični možganski kapi kot tudi njenim možnim mehanizmom.Metode:Raziskali smo zaščitne učinke izvlečkov izC. deserticolaskupnih glikozidov (TG), polisaharidov (PS) in oligosaharidov (OS) v podganjem modelu okluzije-reperfuzije srednje možganske arterije (MCAO/R). 2, 3, 5-Barvanje s trifenil tetrazolijevim kloridom (TTC) je bilo uporabljeno za oceno volumna možganskega infarkta, Evansov modri test pa je bil sprejet za oceno prepustnosti krvno-možganske pregrade (BBB). Nato izrazi CD31, a-SMA, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, ZO-1, claudin-5, occludin, Keap-1 in Nrf{{ 12}} smo analizirali z uporabo western blottinga ali imunofluorescence, aktivnosti MDA, SOD, CAT in GSH-Px pa smo analizirali z uporabo kompletov.Rezultati:Zdravljenje s TG je izjemno zmanjšalo rezultate nevrološkega izpada in obseg infarkta, spodbudilo angiogenezo in nevralno preoblikovanje ter učinkovito ohranilo celovitost krvno-možganske pregrade v primerjavi z modelno skupino. Poleg tega so TG znatno znižali ravni MDA in povečali antioksidativne aktivnosti (SOD, CAT in GSH-Px) v možganih. Medtem so TG izjemno znižali ekspresijo Keap-1 in olajšali jedrsko translokacijo Nrf-2. Nasprotno, za skupine PS in OS niso opazili zaščitnih učinkov.Zaključek:TG so glavne aktivne sestavineC. deserticolaproti možganski poškodbi, ki jo povzroči MCAO/R, zaščita pa poteka predvsem prek poti Nrf-2/Keap-1.

Ključne besede: Cistanche deserticola, možganska poškodba, skupni glikozidi, polisaharidi, oligosaharidi, pot Nrf-2/Keap- 1

UVOD

Možganska kap velja za glavni vzrok smrti in invalidnosti v svetu (Donnan et al., 2008). Skoraj 87 odstotkov vseh primerov možganske kapi povzroči ishemična možganska kap (Ovbiagele in Nguyen-Huynh, 2011). Trenutno najučinkovitejše sredstvo in edino zdravilo, odobreno s strani FDA, ki se uporablja za zdravljenje ishemične možganske kapi, je rekombinantni tkivni aktivator plazminogena. Vendar se veliko število bolnikov z možgansko kapjo ne odzove na to zdravilo zaradi njegovega ozkega terapevtskega časovnega okna in resnega tveganja za hemoragične zaplete (Lee et al., 2012; Schellinger in Kohrmann, 2014). Glavni izziv trombolitičnega zdravljenja je ishemična/reperfuzijska (I/R) poškodba, ki velja za glavni vzrok za poškodbo možganov in uničenje funkcije. Reperfuzija po cerebralni ishemiji poveča tveganje za možgansko krvavitev, hkrati pa vodi do nevrovaskularne poškodbe in proizvaja prekomerne reaktivne kisikove vrste (ROS), ki poškodujejo krvno-možgansko pregrado (Alluri et al., 2015). Več študij je potrdilo, da je motnja BBB glavni vzrok za patogenezo ishemične možganske kapi (Cao et al., 2016b).

BBB je sestavljen predvsem iz endotelijskih celic, pericitov, astrocitov, nevronov in bazalnih membran. Osrednje komponente BBB so cerebralne mikrovaskularne endotelijske celice, ki so povezane s tesnimi stiki in tako omejujejo eksogene molekule v možgane. Patološke spremembe tesnih stikov – zlasti okludina, klaudina-5 in zonula occludens-1 (ZO-1) – pomembno vplivajo na delovanje BBB med ishemično možgansko kapjo, zlasti na prepustnost bariere (Liu et. sod., 2014; Hu in sod., 2018; Liu in sod., 2019). Med obdobji I/R je čezmerni ROS eden glavnih dejavnikov, ki vodijo do neposredne poškodbe možganskih nevronov (Ding et al., 2014). Prekomerna proizvodnja ROS vodi do degradacije določenih stičišč in motenj BBB, kar ima za posledico vstop eksogenih molekul v možgane skozi BBB, kar vodi do poslabšanja možganske poškodbe (Cheon et al., 2016; Zhang QY et al., 2017). Zato je bila zaščita BBB z antioksidanti obravnavana kot možen način za preprečevanje reperfuzijske poškodbe.

Poleg razgradnje BBB lahko I/R povzroči nevrovaskularno poškodbo in nevronsko smrt (Jung et al., 2010). Med možgansko kapjo je lahko povečana smrt nevronskih celic posledica oksidativnega stresa (Chi et al., 2018), številne študije pa so pokazale, da ROS poslabša resnost kapi in nevrološke poškodbe (Kondo et al., 1997; Crack et al., 2001; Crack et al., 2006). Čeprav klinična preskušanja niso dala zadovoljivih rezultatov, je nevroprotekcija še vedno obetavna strategija za zdravljenje akutne ishemične možganske kapi (Moretti et al., 2015). Zato je iskanje učinkovitih nevroprotektivnih zdravil za zdravljenje kapi korist za bolnike z možgansko kapjo.

Tradicionalna kitajska medicina (TKM) sprejema ukrepe za posredovanje proti notranjemu neravnovesju telesa (Gaire, 2018). Zaradi kompleksne patogeneze ishemičnih možganskih kapi ima večfaktorski učinek TKM in njegovih aktivnih sestavin ključno vlogo pri zdravljenju možganske kapi. Cistanche deserticola YC Ma, razširjena v sušnih ali polsušnih območjih po vsej Mongoliji in severozahodni Kitajski, se na Kitajskem že več kot 1 000 leto pogosto uporablja v tradicionalni medicini za zdravljenje različnih bolezni, kot sta pozabljivost in depresija. . Modernofarmakološke študije so pokazale, da surovi izvlečki izC. deserticolaje pokazalo več farmakoloških aktivnosti, kot so izboljšanje učenja in spominske funkcije, nevroprotekcija, krepitev imunosti, antioksidativni učinki, učinki proti staranju in utrujenosti (Ko in Leung, 2007; Wang et al., 2012; Li et al., 2015). Kemijska analiza C. deserticola je pokazala, da njegove glavne sestavine vključujejo feniletanoidne glikozide, iridoidne glikozide, polisaharide in oligosaharide (Jiang in Tu, 2009). Vendar pa aktivne sestavine C. deserticola za zaščito možganov niso zelo jasne.Nevroprotektivna lastnost C. deserticola nakazuje njen terapevtski potencial pri boleznih, povezanih s kognitivnimi funkcijami, kot sta možganska kap in depresija, pa tudi Alzheimerjeva bolezen (Wang et al., 2017). Vendar raziskave o vplivuC. deserticolana možgansko kap, vključno z njegovimi aktivnimi sestavinami in mehanizmi delovanja, je zelo omejen. V trenutnem delu smo raziskovali zaščitni učinek treh izvlečkov iz C. deserticola, skupnih glikozidov (TG, feniletanoidni glikozidi in drugi glikozidi), polisaharidov (PS) in oligosaharidov (OS) na cerebralne I/R poškodbe. Naše ugotovitve lahko prispevajo k natančni klinični uporabiC. deserticolain zagotoviti kandidatno sredstvo za zdravljenje ishemične možganske kapi.

MATERIALI IN METODE

Kemikalije in reagenti

Stebla Cistanche deserticola so bila kupljena pri Alashanu v Notranji Mongoliji in jih je identificiral eden od avtorjev (P.-F. Tu). TG, PS in OS so bili pripravljeni v skladu z našo predhodno opisano metodo (Gao et al., 2015). Kvantitativna analiza TG je bila izvedena s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC), kot je opisano prej (Li et al, 2019), njen kromatogram pa je prikazan na sliki 1. Glavne sestavine TG so ehinakozid, tubulozid A, akteozid, izo- akteozid in 2'-acetilakteozid; njihove vsebnosti so 163,05 mg/g, 4,125 mg/g, 41,66 mg/g, 22,655 mg/g in 12,045 mg/g. Vsebnosti PS in OS znašajo 69,42 odstotka oziroma 65,24 odstotka, kot je določeno s HPLC oziroma analizo fenola in žveplove kisline (Zhang A. et al., 2018; Shi et al, 2019).

Standardne reference ehinakozida (A0282), tubulozida A (A0942), akteozida (A0280), izoakteozida (A0281) in 2'-acetilakteozida (A0943) so bile kupljene pri Chengdu Must Biotechnology (Sichuan, Kitajska). Čistost vseh standardov je več kot 98 odstotkov. Kompleti Nissl stain H&E so bili kupljeni pri Bosterju (Wuhan, Kitajska). Edaravone (T0407-1) je bil kupljen pri Target Mol (Šanghaj, Kitajska). Kupljeni so bili zajčji protipodganji MAP-2 (ab32454), Nrf-2 (ab31163), PDGFRb (ab32570), Keap-1 (ab66620) in mišji protipodganji CD31 (ab24590). od Abcam Inc (Cambridge, MA, ZDA). Claudin5 (BS1069), ZO-1 (BS9802M) in Occludin (BS72035) so bili kupljeni pri Bioworld Technology (Nanjing, Kitajska). Cell Signaling Technology Inc. (Boston, MA, ZDA) je bil vir kunčjega protipodganjega sinapsina-1 (SYN,5297T), PSD95 (3450T), a-Smooth Muscle Actin (a-SMA,19245T). GAPDH (HRP-60004) je bil kupljen pri Proteintech Group, Inc. (Chicago, ZDA). Sekundarna protitelesa je dobavila Zhongshan Golden Bridge Biotechnology (Peking, Kitajska). Hoechst 33258 je bil pridobljen pri Beyotime (Jiangsu, Kitajska).

Živali

Podgane Sprague-Dawley (samci, težki 250–300 g) so bile pridobljene iz Vital River Laboratory Animal Technology (Peking, Kitajska) in nameščene v klimatiziranem prostoru, ki je bil v 12-urnem ciklu svetloba/tema. Vsi poskusi na živalih so bili izvedeni v skladu s smernicami ARRIVE raziskave na živalih (Kilkenny et al., 2010; McGrath et al., 2010) in jih je odobril Institucionalni odbor za oskrbo in uporabo živali Zdravstvenega znanstvenega centra Pekinške univerze (LA2019123).

Protokoli poskusov na živalih

Podgane so bile izpostavljene MCAO/R, kot je opisano prej (Wang et al., 2018). Na kratko, izpostavljene so bile leva skupna karotidna arterija (CCA), zunanja karotidna arterija (ECA) in notranja karotidna arterija (ICA) in 3-0 najlonski monofilamentni šiv je bil vstavljen iz ECA v ICA, dokler ni dosegel sredine možganska arterija (MCA). Po 1,5 urah okluzije MCA je bila reperfuzija simulirana z odstranitvijo filamenta. Med kirurškim posegom je bila telesna temperatura vseh podgan vzdrževana pri 37,0 stopinjah.

Uprava za zdravila

Podgane so bile naključno ločene v šest skupin z uporabo programske opreme SPSS različice 22.0, kot je opisano (Jiang et al., 2014): normalna skupina (NOR); skupina modelov (MOD); skupina edaravona (pozitivno zdravilo, 6 ml/kg, EDI); skupina TG (280 mg/kg, TG); Skupina PS (280 mg/kg, PS) in skupina OS (280 mg/kg, OS). TG, PS in OS so dajali enkrat na dan po MCAO/R 14 dni. Skupini NOR in MOD sta bili zdravljeni z navadno fiziološko raztopino. Število živali je prikazano v tabeli 1.

Merjenje telesne teže in ocene modificiranega nevrološkega primanjkljaja (mNSS)

Telesno težo smo spremljali 14. dan z uporabo digitalne tehtnice ADVENTURE™ (OHAUS, New Jersey, ZDA). mNSS je bil ocenjen po metodi, ki jo je opisal FJ Wang (Wang et al., 2018), z manjšimi popravki.

2, 3, 5-barvanje s trifeniltetrazolijevim kloridom (TTC)

Volumen infarkta je bil izmerjen, kot je opisano prej (Wang et al., 2015). Na kratko, možgane so razdelili na sedem enako razmaknjenih koronarnih blokov (2 mm). Ti odseki so bili obarvani z 2 odstotkom TTC (Coolaber, Peking, Kitajska) pri 37 stopinjah 15 minut. Volumen infarkta (v odstotkih)=(volumen ipsilateralne ishemične hemisfere − volumen kontralateralne ishemične hemisfere)/volumen kontralateralne ishemične hemisfere × 100.

Nissl in H&E barvanje

Podgane so bile globoko anestezirane, celotni možgani pa so bili nato hitro odstranjeni iz lobanje in fiksirani s 4-odstotnim paraformaldehidom in vdelani v parafinski vosek ter razrezani na rezine debeline 7 µm. Odseke smo obarvali z Nisslom in H&E. V tej študiji je bilo v vsakem vzorcu tkiva s svetlobnim mikroskopom zajetih šest naključnih polj 200 × 200 µm. Število Nisslovih trupel je bilo prešteto s programsko opremo IPP različice 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, ZDA).

Evansov modri test

Podganam so vbrizgali 2 odstotka EB (Coolaber Science & Technology Co., LTD) po MCAO/R. Dve uri pozneje so podgane anestezirali in nato na hitro odstranili celotne možgane in jih homogenizirali v acetonu. Supernatante smo analizirali pri 620 nm z bralnikom absorbance 800 TS (BioTek, ZDA).

Merjenje aktivnosti katalaze (CAT), superoksid dismutaze (SOD), malondialdehida (MDA) in glutation peroksidaze (GSH-Px)

Vse vzorce seruma smo centrifugirali pri 4,000 × rpm 15 minut pri 4 stopinjah in nato analizirali za odkrivanje aktivnosti MDA, CAT, SOD in GSH-Px po navodilih proizvajalca (Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd, Kitajska).

Western blotting analiza

Možganska tkiva (100 mg), zbrana od vsake podgane, so bila homogenizirana in lizirana v pufru za lizo RIPA in nato analizirana za odkrivanje koncentracije beljakovin z uporabo kompleta BCA (Beijing TransGen Biotech Co., Ltd.). Skupne tkivne beljakovine smo naložili na 10-odstotne SDS-PAGE gele in prenesli na nitrocelulozno membrano. Membrana je bila blokirana s 5-odstotnim posnetim mlekom, nato pa čez noč inkubirana s primarnimi protitelesi pri 4 stopinjah. Membrana je bila nato inkubirana s sekundarnim protitelesom. Western blot analiza je bila analizirana z uporabo Kodak Digital Imaging System (5200 Multi, Tanon, Kitajska).

Imunofluorescentna analiza

Izvedeno je bilo imunofluorescenčno barvanje za CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, occludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, Nrf-2 in Keap-1. Primarna protitelesa proti Nrf-2, CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, okludinu, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2 in Keap-1 so bila razredčena na 1:200 oziroma 1:100. Sekundarno protitelo Alexa Flur 488 mišjega proti kunčjemu IgG in rodaminskega (TRITC) kozjega proti kunčjemu IgG sta bila oba razredčena na 1:200. Jedra so bila obarvana s Hoechst 33258. Slike so bile zajete z uporabo Vectra® Polaris™ Automated Quantitative Pathology Imaging System (PerkinElmer, ZDA). Ekspresijo beljakovin smo analizirali z uporabo programske opreme IPP različice 6.0.

Statistična analiza

Vsi podatki so bili opisani kot povprečje ± SD. Za statistično analizo je bila izvedena različica programske opreme SPSS 22.0. Enosmerna ANOVA je bila uporabljena pri primerjavi različnih skupin. P < 0.05="" je="" veljalo="" za="" statistično="">

REZULTATI

TG povečajo telesno težo in zmanjšajo poškodbe možganov pri podganah MCAO/R

Po 14 dneh zdravljenja s TG, PS, Oss in EDI so ovrednotili telesno težo, nevrološke izpade in obseg infarkta I/R podgan. Rezultati so pokazali, da so se telesne teže v skupini MOD močno zmanjšale, medtem ko so se zmanjšane teže v skupinah TG, PS in EDI povečale (slika 2A). Rezultati nevrološkega primanjkljaja so bili znatno znižani z EDI in TG (slika 2B). Rezine možganov pri podganah iz skupine NOR so bile temno rdeče in ni bilo infarktov, medtem ko so podgane iz skupine MOD pokazale velik ipsilateralni možganski infarkt. Po zdravljenju s TG so bili infarktni volumni znatno zmanjšani (sliki 2C, D). Zdravljenje s PS in OS ni pokazalo očitnega učinka na zgornje indekse. Zgornji podatki so pokazali, da lahko TG izrazito ublažijo možgansko poškodbo, ki jo povzroči I/R, vendar PS in OS ne morejo.

TG izboljšajo histopatološke poškodbe pri podganah MCAO/R

Za določitev nekaterih učinkov zdravljenja s TG, PS in OS na histopatološke poškodbe je bilo opravljeno barvanje s H&E, da bi razkrili patološke poškodbe. Histomorfološke strukture možganov v skupini NOR so bile pravilno urejene. Morfološke spremembe v skupinah TGs so bile manjše od tistih v skupini MOD. Vendar pa skupine za zdravljenje s PS in OS niso pokazale pomembnega izboljšanja morfoloških sprememb (slika 3).

TG zmanjšajo nevronske poškodbe po I/R-induciranih podganah

Barvanje po Nisslu je pokazalo histopatološke spremembe nevronov v penumbri ishemične regije. Kot je prikazano na sliki 4, so imeli normalni nevroni jasen nukleolus in nedotaknjeno strukturo. V skupini MOD so imeli nevroni povečane medcelične prostore. Nisslova telesa so izginila, skrčena in globoko zamazana. Vendar so bile te spremembe redko opažene v skupinah EDI, TG in PS. Ti rezultati so pokazali, da lahko TG in PS znatno zmanjšajo nevronsko poškodbo, ki jo povzroči ishemija/reperfuzija.

TG zmanjšajo motnje BBB po podganah, zdravljenih z I/R

Evansov modri test je klasična metoda za raziskovanje spremembe prepustnosti BBB. Rezultati poskusa so pokazali, da so v skupini MOD opazili povečano Evans modro, medtem ko je bilo pri podganah, zdravljenih s TG in EDI, znatno zmanjšano Evans modro. Poleg tega ni bilo pomembne razlike med terapevtskimi skupinami PS in OS (slika 5). Ti rezultati kažejo, da bi lahko TG znatno zmanjšali motnje BBB.

TG spodbujajo angiogenezo pri I/R poškodovanih podganah

Novejše študije kažejo, da ima angiogeneza ključno vlogo pri nevrološkem funkcionalnem okrevanju in prognostičnem izidu po akutni ishemični možganski kapi (Yuen et al., 2015). Za ovrednotenje učinkov TG, PS in OS na angiogenezo sta bila CD31 in a-SMA uporabljena za kvantifikacijo kapilarnega števila. Imunofluorescenčno barvanje je pokazalo, da je skupina MOD povzročila izjemno zmanjšanje izražanja CD31 (sliki 6A, B) in a-SMA (sliki 6C, D) v penumbri ishemičnih območij podgan I/R v primerjavi z normalnimi podganami . Ta rezultat je pokazal, da lahko I/R povzroči vaskularno poškodbo v korteksni penumbri ishemičnih hemisfer. Vendar pa je zdravljenje s TG in EDI izjemno povečalo gostoto kapilar, angiogenezo in arteriogenezo, kot kaže povečano izražanje CD31 in a-SMA. Ti rezultati kažejo, da bi lahko TG spodbujali angiogenezo v ishemični penumbri I/R podgan, PS in OS pa ne.

TG povečajo izražanje proteinov tesnega spoja pri I/R poškodovanih podganah

Motnje BBB lahko povečajo vsebnost vode v možganih in otekanje tkiva, kar povzroči poškodbo možganov. Beljakovine tesnega stika so pomembne strukturne komponente BBB (Tenreiro et al., 2016; Jiang et al., 2018). Da bi preverili, ali lahko zdravljenje s TG, PS in OS po možganski kapi vpliva na celovitost BBB, so z imunofluorescenčno analizo izvedli izražanje ZO-1, claudina-5 in okludina. Rezultati so pokazali, da je bilo izražanje claudina-5, okludina in ZO-1 vidno zmanjšano v skupini MOD. Vendar pa so se znatno povečali po 14 dneh dajanja TG. Skupine PS in OS niso pokazale pomembnih sprememb v izražanju teh beljakovin (slika 7). Ti podatki so pokazali, da lahko TG uravnavajo ekspresijo beljakovin tesnega stika in verjetno ohranijo celovitost BBB po poškodbi I/R. TG povečajo pokritost s periciti na kapilarah pri I/R poškodovanih podganah Pokritost s periciti na kapilarah igra ključno vlogo pri ohranjanju celovitosti BBB (Armulik et al., 2010; Daneman et al., 2010). Tako smo preizkusili, ali je mogoče povečati pokritost pericitov z zdravljenjem s TG, PS in OS. Rezultati analize intenzivnosti imunofluorescence so pokazali, da sta se izrazi PDGFRb in CD31 dramatično zmanjšali v skupini MOD. Dajanje TG podganam I/R je znatno obnovilo ali celo povečalo intenzivnost ekspresije PDGFRb in CD31, vendar v skupinah, zdravljenih s PS in OS, niso opazili nobene razlike (slika 8). Tako bi zdravljenje s TG lahko znatno povečalo pokritost pericitov. Te ugotovitve so dodatno potrdile, da lahko TG ohranijo celovitost BBB po I/R.

TG spodbujajo nevronsko preoblikovanje pri I/R poškodovanih podganah

Glede na številne študije lahko nevrogeneza po možganski kapi bistveno izboljša funkcionalno okrevanje (Grefkes in Ward, 2014; Zhang et al., 2019). Sinaptofizin (SYN), proteini postsinaptične gostote 95 (PSD-95) in protein 2 (MAP-2, povezan z mikrotubulami) so bili uporabljeni kot markerji za preučevanje nevronske plastičnosti v ishemični penumbri korteksa. Za oceno učinkov zdravljenja s TG, PS in OS na nevrogenezo pri podganah, poškodovanih z I/R, sta bila izvedena imunofluorescenca in western blot za izraze SYN, PSD95 in MAP-2. Kot je prikazano na slikah 9 in 10, so se ravni izražanja SYN, PSD95 in MAP-2 pri podganah I/R po 14 dneh reperfuzije zmanjšale v primerjavi s podganami NOR, medtem ko bi lahko zdravljenje s TG in PS znatno povečalo. uravnavajo njihove ravni izražanja. Skupina OS ni imela bistvenih sprememb v primerjavi s skupino MOD. Podatki so pokazali, da je zdravljenje s TG in PS lahko dramatično spodbudilo nevronsko preoblikovanje po poškodbi I/R.

TG spremenijo izraze Nrf-2 in Keap-1 pri I/R poškodovanih podganah

Oksidativni stres je glavni patogeni mehanizem pri poškodbi I/R (Ya et al., 2018; Yu et al., 2018). Študije so potrdile, da je Nrf-2 glavni regulator antioksidativnih odzivov (Thompson et al., 2015). Da bi raziskali oksidativne odzive, posredovane z Nrf-2 in Keap-1, po poškodbi I/R, smo ocenili citoplazmatsko izražanje kot tudi jedrsko translokacijo Keap-1. Medtem je bila testirana tudi ekspresija Nrf-2 v I/R poškodovanih možganskih tkivih podgan (sliki 10 in 11). Po imunofluorescenčni analizi je bilo ugotovljeno, da se Nrf-2 večinoma nahaja v citoplazmi v skupini NOR. V skupini TGs je bilo izražanje Nrf-2 v citoplazmatski lokalizaciji znižano, vendar navzgor regulirano v jedru, opazili pa so tudi zmanjšano izražanje Keap-1. Podatki so pokazali, da je zaščita možganov s TG lahko povezana z modulacijo Nrf-2 in Keap-1

TG zmanjšajo oksidativni stres možganskega tkiva pri podganah, poškodovanih z I/R

Za potrditev antioksidativnih učinkov TG so bile aktivnosti SOD, CAT, GSH-Px in MDA ocenjene pri I/R poškodovanih podganah. Na sliki 12 je bila vsebnost MDA izrazito povečana v skupini MOD, hkrati pa so bile zmanjšane aktivnosti SOD, CAT in GSH-Px v primerjavi z normalnimi podganami. Nasprotno pa je zdravljenje s TG povzročilo znatno zmanjšanje vsebnosti MDA in povečanje aktivnosti SOD, CAT in GSH-Px. Ti rezultati so nadalje potrdili antioksidacijsko aktivnost TG.

DISKUSIJA

Številne študije kažejo, da TKMC. deserticolaima obsežne biološke aktivnosti, npr. izboljšanje sposobnosti učenja, spomina in imunosti (Dong et al., 2007; Jiang in Tu, 2009; Wang et al., 2017; Xia et al., 2018). Vendar ostajajo aktivne sestavine C. deserticola za nevroprotekcijo nejasne. Namen trenutnega dela je pregledati aktivne komponente izC. deserticolaproti ishemični možganski kapi na modelu MCAO/R. Trije izvlečki iz C. deserticola (TG, PS in OS) so bili uporabljeni za oceno njihovih učinkov na podgane MCAO/R, kot tudi možnih mehanizmov.

Možganska kap je pogosta akutna cerebrovaskularna bolezen. Epidemiološke študije kažejo, da je možganska kap pogostejša pri moških kot pri ženskah (Sealy-Jefferson et al., 2012; Guzik in Bushnell, 2017). Tako so bili v našem poskusu za teste sprejeti podganji samci. Naši rezultati so dokazali, da je indukcija I/R pospešila oksidativni stres in volumen infarkta, zlomila BBB in povzročila poškodbo živcev in možgansko-žilnih poškodb. Po pregledu je bilo ugotovljeno, da TG zmanjšujejo volumen infarkta in spodbujajo nevronsko preoblikovanje in angiogenezo. Poleg tega so opazili, da TG ohranjajo integriteto BBB po poškodbi I/R. Ravno nasprotno, PS in OS ne prinašajo pomembnega olajšanja poškodbe I/R. Tako se TG štejejo za glavno aktivno frakcijoC. deserticolaza nevroprotekcijo, potencialno s spodbujanjem nevronskega preoblikovanja, angiogeneze in celovitosti BBB prek aktiviranja poti Nrf- 2/Keap-1.

Vse več dokazov kaže, da je vzpostavitev učinkovite kolateralne cirkulacije zelo pomembna za preprečevanje nastanka infarkta in ishemične penumbre ter je kritično zdravljenje v zgodnji fazi ishemične možganske kapi (ElAli, 2016; Iwasawa et al., 2016). Proliferacija vaskularnih endotelijskih celic in celic gladkih mišic po ishemičnem infarktu določa vzpostavitev kolateralnega krvnega obtoka. Vendar pa imajo modeli ishemije skupen pojav - to je, da je oksidativni stres široko prisoten v možganski mikrovaskulaturi. Podatki študije so pokazali, da lahko veliko število antioksidantov moti delovanje BBB in lastnosti angiogeneze (Mentor in Fisher, 2017). CD31 in a-SMA sta označevalca vaskularnih endotelijskih celic in gladkih mišičnih celic (Saboor et al., 2016). Raziskati učinek na zgoraj omenjeno celično proliferacijo izvlečkov izC. deserticola, smo pregledali ekspresijo CD31 in a-SMA v cerebralno ishemičnem homogenatu penumbra. Naši podatki so pokazali, da so TG osupljivo okrepili izražanje CD31 in a-SMA. Vendar ni bilo pomembnih razlik za skupine PS in OS. Zato smo sklepali, da lahko TG zmanjšajo poškodbe možganov s spodbujanjem angiogeneze s povečanjem izražanja CD31 in a-SMA, medtem ko PS in OS niso zagotovili takšne zaščite pred poškodbami možganov. Ti rezultati so dodatno potrdili, da lahko samo TG preprečijo cerebralno I/R poškodbo.

Ishemično možgansko kap je mogoče obravnavati kot rezultat cerebralne ishemije, ki jo povzroči okvara nevronske plastičnosti ali preoblikovanje možganskih področij. Večina bolnikov po možganski kapi ima nevrološke izpade. Aktivacija nevrogeneze je obetavna strategija za bolnike z možgansko kapjo za izboljšanje njihovih nevroloških funkcij (Cramer in Chopp, 2000). Nevrogeneza neposredno sodeluje pri okrevanju nevroloških funkcij po možganski I/R poškodbi (Zhang et al., 2019). Prejšnje raziskave kažejo, da lahko TG izboljšajo stopnjo preživetja hipokampalnih piramidnih celic in inducirajo nevrogenezo (Lian et al., 2017). Oksidativni stres povzroča izgubo nevronov med številnimi boleznimi, kot so Parkinsonova bolezen, možganska kap itd. (Duan in Si, 2019; Singh et al., 2019). Nrf-2 prepisuje veliko genov, povezanih z nevroprotekcijo v njihovi promocijski regiji, predvsem vključno s SOD, MDA, CAT in g glutamil cistein ligazami itd. (Satoh et al., 2006). Proteini SYN, PSD-95 in MAP-2, ki so tesno povezani s sinaptično tvorbo in nevrotransmisijo, se lahko štejejo za označevalce raziskovalne nevronske plastičnosti v ishemični regiji penumbra. Po študiju smo ugotovili, da lahko zdravilo s TG znatno poveča izražanje PSD95, SYN in MAP-2, kar kaže, da je cerebralna zaščita TG povezana z okrepljeno nevronsko plastičnostjo med I/R. Vendar je škoda, da ni očitne razlike med skupinami PS in OS. Ti rezultati so pokazali, da lahko TG povečajo nevroplastičnost po cerebralni I/R poškodbi.Raziskave slikanja pri bolnikih z možgansko kapjo so pokazale, da lahko disfunkcijo BBB obravnavamo kot osupljiv atribut periishemičnih možganov (Bang et al., 2007). TJ, ki so sestavljeni iz citoplazemskih proteinov, transmembranskih proteinov in spojnih adhezijskih molekul med endotelnimi celicami kapilar, so zelo pomembni pri ohranjanju celovitosti BBB (Ye et al., 2019). Med njimi so ZO-1, claudin-5 in okludin najpomembnejši proteini v TJ. Vse več dokazov kaže, da je povečana prepustnost BBB, ki jo povzroča ishemija, na splošno povezana s spremembami ZO-1, claudina-5 in okludina (Cao et al., 2016a; Page et al., 2016; Yu et al., 2017; Liu et al., 2018). V tem delu so rezultati pokazali, da čeprav lahko TG znatno povečajo izražanje proteinov ZO-1, claudin-5 in okludinskih proteinov v možganskih tkivih, ki jih povzroča MCAO, tega niso storili niti PS niti OS. BBB je sestavljen iz cerebralnih endotelijskih celic in je tesno povezan s periciti (Nyul-Toth et al., 2016). Periciti so ključni za celovitost BBB (Bell et al., 2010). Ishemična možganska kap sproži smrt pericitov in odstop od možganskih endotelijskih celic v akutni fazi, s čimer destabilizira mikrovaskulaturo in spremeni lastnosti BBB (Zechariah et al., 2013). Naši podatki so pokazali, da lahko TG povečajo pokritost pericitov na kapilarah in povečajo ravni izražanja ZO-1, claudina-5 in okludina. Ti pojavi so dokazali, da lahko TG učinkovito zaščitijo celovitost BBB po cerebralni I/R poškodbi. Če povzamemo, lahko TG zmanjšajo cerebralno poškodbo na več načinov, kot je spodbujanje angiogeneze, izboljšanje plastičnosti nevronov in ohranjanje celovitosti BBB.

Nato smo raziskali signalno pot, da bi raziskali mehanizem, na katerem temelji zaščita možganov TG. Proces poškodbe I/R je večfaktorski, zato so v patogenezo vključeni številni mehanizmi. Oksidativni stres je temeljni dejavnik tveganja, ki prispeva k poškodbam možganov, ki jih povzroči I/R (Suda et al., 2013), kot so poškodbe strukture BBB, vaskularna endotelna disfunkcija in poslabšanje ishemične nevronske poškodbe (Xiong et al., 2015; Caglayan et al., 2019; Priestley et al., 2019). Tako je oksidativni stres postal privlačna terapevtska tarča pri poškodbi možganov, ki jo povzroči I/R. Encimi faze 2, ki jih posreduje faktor, povezan z jedrskim faktorjem E2--2 (Nrf-2), veljajo za pomembno sredstvo, s katerim se nevroni ščitijo pred oksidativnim stresom (Suzuki in Yamamoto, 2015; Ya et al., 2018). Vse več dokazov kaže, da je aktivacija Nrf-2 med I/R potencialna terapevtska tarča za nevroprotekcijo (Ding et al., 2015; Zhang R. et al., 2017). Nrf-2 kot pomemben regulator endogene antioksidativne obrambe posreduje na ravni hemoksigenaze 1 (HO-1) in drugih antioksidativnih encimov, kot je NAD(P)H kinon oksidoreduktaza 1 (NQO1), SOD, CAT, GSH in MDA (Siow et al., 2007; Ding et al., 2014). Poleg tega ima Nrf-2 pomembno regulatorno vlogo pri angiogenezi. Ta študija kaže, da je Nrf-2 mogoče znatno izboljšati in aktivirati v procesu vaskularnega razvoja (Wei et al., 2013).

Kot je bilo že opisano (Jiang in Tu, 2009), TG vsebujejo veliko bioaktivnih spojin, na primer ehinakozid, tubulozid A, akteozid, izo-akteozid in 2'-acetilakteozid, in nekateri od njih so pokazali nevroprotektivne funkcije po cerebralni I/R poškodbe (Peng et al., 2016). Ehinakozid ima veliko farmakoloških učinkov, kot so antioksidacija, proti staranju, nevroprotekcija, protivnetje, spodbujanje brazgotin, hepatoprotekcija, spodbujanje tvorbe kosti in protitumorske aktivnosti (Yu et al., 2016; Li et al., 2018; Zhang Y. et al., 2018; Ji et al., 2019; Xu et al., 2019). Pred kratkim je bil ehinakozid identificiran kot močan antioksidant v centralnem živčnem sistemu (Lu et al., 2016). Ehinakozid lahko zmanjša vsebnost MDA in izboljša aktivnosti SOD in GSH Px pri ishemični možganski poškodbi, analiza molekularnega spajanja pa je pokazala, da se lahko ehinakozid veže na Keap-1, kar vodi do jedrske translokacije Nrf-2 (Li et al., 2018). Študija Xia je pokazala, da bi lahko akteozid zmanjšal volumen infarkta in vsebnost vode v možganih za izboljšanje nevroloških izpadov pri podganah MCAO/R z ublažitvijo oksidativnega stresa (Xia et al., 2018). Druge študije so pokazale, da bi lahko izoakteozid povečal aktivnosti celičnih antioksidativnih encimov, SOD in CAT v celicah V79-4, obdelanih s H2O2- (Chae et al., 2005). Na podlagi zgornjih poročil o aktivnih spojinah, ki jih vsebujejo TG, je mogoče sklepati, da bi TG lahko zaščitili pred ishemično možgansko kapjo preko antioksidacijskih poti.

Li je poročal o nevroprotektivnih učinkih feniletanoidnih glikozidov (PhG) na apoptozo, ki jo povzroča H2O2- na celicah PC12 prek poti Nrf2/ARE (Li et al., 2018). Ti PhG so bili znatno potlačeni s sprožitvijo jedrske translokacije Nrf2 in povečanim izražanjem HO-1, NQO1, katalitične podenote glutamat-cistein ligaze (GCLC) in podenote modifikatorja glutamat-cistein ligaze (GCLM) (Li et al., 2018). ; Gong et al., 2019). Zato te ugotovitve kažejo, da ima pot Nrf-2/ARE ključno vlogo pri zaščitnih učinkih, ki jih posredujejo PhGs, na nevronske celice. Podobno smo v tej študiji ugotovili, da lahko TG znižajo raven MDA in povečajo ravni SOD, CAT in GSH-Px pri podganah I/R. Medtem bi lahko TG povečali izražanje Nrf2 v jedru, zmanjšali ustrezno izražanje v citoplazmi in znatno zmanjšali izražanje Keap-1. Zato je lahko pot Nrf-2/Keap-1 vključena v nevroprotektivne učinke, ki jih posredujejo TG. Nadaljnja validacija te poti bi se v prihodnosti izvajala v celični kulturi in vitro z modeli poškodb zaradi pomanjkanja kisika in glukoze/reoksigenacije. Še več,C. deserticolaizvlečke smo v naši študiji dajali 14 dni neprekinjeno. Ker bi nevrogeneza pri odraslih vplivala na razlago nevroprotektivnih učinkov v 14 dneh reperfuzije, nevrogeneze ni mogoče izključiti v našem trenutnem načrtu eksperimenta pri raziskovanju nevroprotektivnega učinka CT. To je omejitev naše raziskave.

Skratka, gre za TG izC. deserticolaki lahko povečajo angiogenezo in nevrogenezo ter ohranijo celovitost BBB pri podganah s poškodbo I/R, ne pa tudi PS in OS. Učinke lahko posreduje aktivacija poti Nrf-2/Keap-1.