Skrajšan glikoprotein E virusa Varicella-zoster je idealen imunogen za načrtovanje cepiva proti Escherichii Coli

Virus Varicella-zoster (VZV) je zelo nalezljiv povzročitelj, odgovoren za bolezni noric in herpes zoster. Kljub visoki učinkovitosti še vedno obstajajo pomisleki glede varnosti in dostopnosti licenciranih cepiv. Tu smo poskušali izdelati imunogen VZV gE z uporabo ekspresijskega sistema E. coli. Ugotovili smo, da se topna ekspresija in izkoristek gE proteina lahko povečata s C-terminalnimi okrnitvami proteina, s čimer se omogoči robusten in razširljiv postopek čiščenja za proizvodnjo cepiva. Svinčeni skrajšani gE (aa 31–358), v nadaljevanju imenovan tgE, je bil homogen monomer v raztopini in je pokazal odlično antigenost. Na koncu smo ocenili in primerjali imunogenost tgE s komercialno vodko LAV in cepivom Shingrix. Ugotovili smo, da je tgE z aluminijem imunogen v primerjavi z vodko LAV. Ob adjuvansu z AS01B je imunizacija z dvema odmerkoma tgE pokazala primerljivo ali boljšo učinkovitost protitelesnih odzivov in celično posredovane imunosti s cepivom Shingrix v enakem odmerku, zlasti glede deleža IFN- -izražanja CD4+ T celice. Skratka, ta metoda ekspresije tgE, posredovane z E. coli, ponuja stroškovno učinkovito in razširljivo strategijo za ustvarjanje idealnega imunogena gE VZV za razvoj cepiv proti noricam in zostru.

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

virus varicella-zoster, glikoprotein E, Escherichia coli, cepivo

UVOD

Virus Varicella-zoster (VZV) je patogeni človeški virus alfa herpesa, ki povzroča dve glavni kategoriji bolezni: primarno okužbo z noricami, zelo nalezljivo boleznijo, za katero so značilni mehurčasti izpuščaj na koži in blagi sistemski simptomi, kot sta vročina in slabo počutje. predvsem pri otrocih; in herpes zoster (HZ), latentna reaktivacija virusa kot odgovor na oslabljen celični imunski sistem, ki ga povzroča staranje in povzroči boleč, lokaliziran vezikularni izpuščaj (HZ) z ali brez številnih drugih zapletov (Cohen, 2013; Heininger in Seward, 2006; Zerboni et al., 2014). Norice in HZ je mogoče preprečiti s cepivi z živimi oslabljenimi virusi (LAV). Prvi LAV za preprečevanje noric so razvili Takahashi et al. (1974), ki temelji na sevu virusa vOka in je bil kasneje licenciran kot Varivax za rutinsko uporabo v Združenih državah. Sledil je razvoj in licenciranje zdravila Zostavax za preprečevanje HZ (Tseng et al., 2011). Na žalost je bilo v 10 letih, odkar so se začela cepljenja z zdravilom Varivax, potrjeno, da je skoraj 1/3 primerov HZ povezana s sevom vOka (Galea et al., 2008), kar nakazuje, da lahko vOka okuži in vzpostavi latenco, kot divji -tipa virusa in se nato ponovno aktivira, da povzroči HZ. Poleg tega je učinkovitost zdravila Zostavax obratno sorazmerna s starostjo bolnika v času dajanja, pri čemer je višja starost povezana z nižjo učinkovitostjo (Oxman et al., 2005). Prejšnje študije so pokazale, da je glikoprotein E (gE) VZV najpogostejši virusni glikoprotein na ovojnici viriona in na površini okužene celice. GE je tudi eden najpomembnejših zaščitnih antigenov VZV, ki lahko inducira celično in humoralno imunost med naravno okužbo z noricami kot tudi po cepljenju z vOka (Arvin, 1992; Oliver et al., 2016). Pred kratkim je bilo odobreno rekombinantno HZ podenotno cepivo Shingrix (HZ/su) za preprečevanje HZ in z njo povezane postherpetične nevralgije (PHN) pri odraslih, starih več kot 50 let (Shah et al., 2019; Syed, 2018). V kliničnih preskušanjih je zdravilo Shingrix povzročilo učinkovito celično posredovano imunost (CMI), specifično za VZV, s skupno učinkovitostjo cepiva 97,2 % med udeleženci, starejšimi od ali enakimi 50 let, in 91,3-odstotno stopnjo zaščite pri udeležencih, večjih ali enakih do 70 let. Te ugotovitve skupaj kažejo na znatno zmanjšano tveganje za HZ pri cepljenih posameznikih neodvisno od starosti in s tem na močnejšo možnost cepiva v primerjavi z zdravilom ZOSTAVAX (Lal et al., 2015; Shah et al., 2019).

rastlina cistanche krepi imunski sistem

Shingrix je zasnovan iz rekombinantnega antigena gE, izraženega v celicah jajčnikov kitajskega hrčka (CHO) in adjuvantnega sistema na osnovi liposomov (AS01B), ki vsebuje 3-Odesacyl-4′-monofosforil lipid A (MPL) in Quillaja saponaria Molina, frakcija 21 (QS21) (Dendouga et al., 2012). Vendar rekombinantne celice CHO zahtevajo dolg proizvodni cikel in so povezane s kompleksnim postopkom čiščenja, ki ima za posledico visoke proizvodne stroške in omejeno ponudbo. Kot tako cepivo Shingrix ni idealna rešitev cepljenja za široko uporabo, zlasti v državah v razvoju (Kim et al., 2012). Mikrobni ekspresijski sistemi ponujajo številne prednosti pred ekspresijskimi sistemi pri sesalcih, vključno s hitro rastjo, enostavnostjo gojenja in nižjimi proizvodnimi stroški (Overton, 2014), zato se pogosto uporabljajo v ekspresiji in proizvodnji številnih biofarmacevtskih izdelkov (Adkins in Wagstaff, 1998; Monie). et al., 2008; Wu et al., 2012). Vendar pa je treba med proizvodnjo premagati več težav za uspešno izražanje rekombinantnih evkariontskih proteinov v prokariontskih sistemih, kot sta nepravilno zvijanje in pomanjkanje posttranslacijske modifikacije (Singh in Panda, 2005). Kljub tem težavam bi mikrobni ekspresijski sistemi lahko ponudili idealen sistem za široko razširjeno, stroškovno učinkovito proizvodnjo cepiv in zato upravičuje preiskavo antigenov iz ekspresijskega sistema E. coli za načrtovanje cepiva proti VZV. V prejšnjem delu smo pokazali uspešno izražanje rekombinantnega gE (rgE) proteina v celicah žuželk in pridobili prečiščene proteine ​​za imunizacijo miši in proizvodnjo mAb (Liu et al., 2015). Na podlagi tega dela tukaj raziskujemo, ali se lahko protein gE izraža v E. coli. Raziskali smo nefuzijsko topno izražanje kandidatnih antigenov gE s prisekanjem C-terminala (v nadaljevanju okrnjeni gE (tgE) ali tgE) v E. coli in karakterizirali očiščene proteine ​​tgE. Pokazali smo, da je prečiščeni tgE antigensko podoben naravnemu gE in sposoben inducirati visoke titre protiteles z vOka-nevtralizirajočo aktivnostjo pri miših. Pri primerjavi imunogenosti antigena tgE, ustvarjenega v naši študiji, z LAV in Shingrixom smo ugotovili, da naš antigen ne kaže le učinkovitega humoralnega odziva, ampak tudi inducira za antigen specifičen CMI. Na splošno lahko naša strategija E. coli za proizvodnjo proteina tgE utre pot alternativnemu industrijsko proizvedenemu imunogenu tako za cepljenje proti noricam kot proti HZ.

koristi cistanche za moške - krepitev imunskega sistema

Kliknite tukaj za ogled izdelkov Cistanche Enhance Imunity

【Vprašajte za več】 E-pošta:cindy.xue@wecistanche.com/Whats App: 0086 18599088692/Wechat: 18599088692

REZULTATI

Izražanje in čiščenje rekombinantnega tgE v E. coli

Sekvence DNA, ki kodirajo zunajcelično domeno VZV gE, so bile pripravljene kot konstrukti z različnimi N- ali C-terminalnimi prirezi in klonirane v vektor pTO-T7 za izražanje proteina v E. coli. Ekstracelularna domena gE v polni dolžini je med izražanjem težila k tvorbi inkluzijskih telesc v E. coli, kar bi lahko izboljšali s prirezovanjem C-terminala. Od različnih okrnjenih proteinov je bila najboljša topnost dosežena s konstruktom gE (aa 31–358) (slika 1A), v nadaljevanju imenovanim okrnjeni gE ali tgE. Kandidat tgE je bil uspešno izražen kot topni rekombinantni protein in očiščen iz supernatanta bakterijskih lizatov z uporabo tristopenjske kromatografije v laboratorijskem merilu za nadaljnjo oceno in razvoj kot potencialno cepivo. Za zajemanje smo uporabili močno anionsko izmenjevalno kromatografijo, ki ji je sledil korak keramičnega hidroksiapatita in hidrofobne kromatografije (slika 1B). V zaporednih fazah postopka čiščenja se je povečala čistost tgE na SDS-PAGE (slika 1C). tgE se je preselil kot približno 40 kD pas in pokazal dobro reaktivnost s specifičnim protitelesom 1B11 (slika 1D). Skupni izkoristek je bil približno 500 ug prečiščenega tgE na gram bakterij.

Karakterizacija okrnjenega gE

Za analizo homogenosti in sedimentacijskih koeficientov prečiščenih proteinov smo uporabili visoko zmogljivo kromatografijo z izključitvijo velikosti (HPSEC) in analitično ultracentrifugiranje (AUC). Protein rgE, prečiščen iz sistema celic žuželk (Liu et al., 2015), je bil uporabljen kot kontrola. Pri HPSEC se je tgE pojavil z ostrim vrhom pri prevladujočem retencijskem času 16,1 min (slika 2A), kar odraža visoko homogenost očiščenih proteinov tgE. V poskusih AUC so prevladujoč sedimentacijski vrh opazili pri ~2,3 S (slika 2B), kar je enako ~39,4 kD, kar kaže, da je tgE v raztopini prisoten kot monomer. Diferencialna skenirajoča kalorimetrija (DSC) je bila uporabljena za testiranje toplotne stabilnosti proteina tgE s spremljanjem toplotne kapacitete med postopkom termičnega odvijanja. Profili DSC so pokazali samo en toplotni prehod med odvijanjem proteina pri vrednosti temperature prehoda (Tm) 63,80 stopinje za tgE, primerljive s tisto za rgE (63,64 stopinje) (slika 2C). Da bi raziskali konformacijsko celovitost prečiščenih proteinov tgE, smo analizirali antigenost tgE s testom ELISA, pri čemer so očiščeni proteini rgE, izraženi v celicah žuželk, služili kot kontrole. V testu ELISA je bilo uporabljenih devet mAb, ki so lahko prepoznala konformacijske epitope (mAb 1B11, 4G4, 14G1) ali linearne epitope (4A2, 11B11, 11B12, 6H6, 10H6, 11E3) (slika 3). Našli smo podobne srednje vrednosti efektivne koncentracije (EC50, ng mL-1) za proteine ​​tgE in rgE za večino protiteles, razen za 1B11, ki je imelo skoraj 10--krat nižjo reaktivnost, kar kaže na njihovo podobno antigenost. Ti rezultati kažejo, da so ključni epitopi na rgE dobro ohranjeni v proteinu tgE.

Slika 1 (Barvno na spletu) Ekspresija in čiščenje proteinov. Shematski prikaz konstrukcije tgE. Celice E. coli smo transformirali z rekombinantnimi plazmidi, ki so nosili skrajšani gen gE (aa 31–358). B, Shematski prikaz postopka čiščenja tgE. tgE smo očistili iz liziranega supernatanta z uporabo tristopenjske kromatografije. C, SDS-PAGE profil tgE med postopkom čiščenja. Molekulska masa tgE je približno 40 kD. M: marker molekulske mase. Proga 1: supernatant, ločen od celičnega lizata; proga 2: frakcija, ki vsebuje tgE iz kromatografa Q-FF; steza 3: frakcija, ki vsebuje tgE iz CHT kromatografa; steza 4: frakcija iz butilnega kromatografa, ki vsebuje protein tgE z visoko čistostjo. D, Imunobloting očiščenega tgE.

Analiza imunskih odzivov, induciranih s tgE pri miših

Za primerjavo imunogenosti tgE z rgE smo formulirali proteine ​​z dvema adjuvantoma, ki se običajno uporabljata za raziskovalno delo: adjuvans na osnovi aluminija Al-001 in Freundov adjuvans. Miši smo imunizirali trikrat v tednih 0, 2 in 4 z odmerkom 1 ug za tgE in rgE z adjuvansom. Titri protiteles, specifični za gE, in odzivi T-celic v 5. tednu po prvi imunizaciji so bili uporabljeni za določanje imunogenosti različnih formulacij adjuvansa. Miši, imunizirane s cepivom tgE, formuliranim z Al-001, so pokazale podobne profile protiteles kot miši v skupini rgE, Freundov adjuvans pa je pokazal boljši učinek stimulacije, če je bil formuliran s tgE kot z rgE (slika 4A). Nevtralizacijski titri niso pokazali razlik pri miših, imuniziranih s tgE ali rgE cepivom, z nevtralizirajočimi titri ~103 za tgE, formuliran z različnimi adjuvansi (slika 4B). Vendar sta pri analizi celic T CD4+ iz splenocitov z barvanjem znotrajceličnih citokinov (ICS) tako cepivi tgE kot rgE izzvali podobne ravni za gE specifičnega IFN- kot v skupini s fiziološko raztopino (slika 4C, ~{ {22}}.1 % za skupine cepiv ali skupino fiziološke raztopine) in le zmerno simulacijo gE-specifičnega IL{{20}} (slika 4D, ~0,2 % za skupine cepiv v primerjavi s ~0,1 % za skupino fiziološke raztopine). Ti rezultati skupaj kažejo, da tgE/Al-001 in tgE/Freundov adjuvans izzoveta gE-specifične imunske odzive, primerljive s tistimi, ki jih sproži rgE, s posebej močnim humoralnim odzivom.

Vrednotenje tgE kandidata za cepivo proti noricam v primerjavi z LAV

Nato smo ovrednotili proizvodnjo protiteles in obstojnost tgE proteinov z adjuvansom aluminija pri miših BALB/c. Dve skupini miši (n=5 na skupino) sta bili imunizirani trikrat v tednih 0, 2 in 4 z različnimi odmerki 0.5 ug in 5 ug tgE/Al{{ 8}} (Sliki 5A in B). Profili protitelesnega odziva so pokazali, da je primarna inokulacija proteina tgE povzročila visoke titre protiteles, s trajnim povečanjem po dveh obnovitvenih imunizacijah v 2. in 4. tednu in doseganjem najvišje ravni v 6. tednu, preden je počasi padel na več kot 1{{ 20}}4 v obdobju spremljanja. Skupine z različnimi odmerki so imele v obdobju spremljanja podobne profile titra protiteles s podobnimi visokimi nevtralizirajočimi titri v 6. tednu. Imunogenost tgE je bila ocenjena in primerjana z vodko. Kot merilo serokonverzije je bil uporabljen polovično učinkovit odmerek (ED50) pri miših, pri čemer nižji ED50 kaže na boljšo imunogenost. Balb/c miši so bile ločene v skupine in intraperitonealno imunizirane z aluminijevim adjuvansom tgE (1, 0.5, 0.25, {{50}}.125, {{ 54}}.0625 ali 0.03125 ug; n{{30}}) ali cepivo vOka (1,000, 500, 250, 125 ali 62,5 pfu; n=6) v serijskih razredčitvah. Serume smo zbrali po 4 tednih in testirali z uporabo ELISA. Serokonverzijo smo analizirali po metodi Reed in Muench (slika 5C). V starostnih skupinah so imele miši stopnje serokonverzije 83 %, 100 %, 100 %, 100 %, 50 % in 17 % za odmerke 1, 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625 oziroma 0,03125 ug. V skupinah z vodko so imele miši nižje stopnje serokonverzije 67 %, 50 %, 33 %, 17 % in 0 % za odmerke 1,000, 500, 250, 125 oziroma 62,5 pfu. Vrednosti ED50 so bile 0,063 ug za tgE in 449,425 pfu za vOka, kar kaže, da je bila imunogenost tgE pri nižjem odmerku 0,3 ug enakovredna tisti, doseženi z enim odmerkom cepiva proti noricam, ki vsebuje vOka (običajno več kot 2,{{78} } pfu na odmerek).

Slika 2 Karakterizacija proteinov tgE in rgE. A, profili HPSEC očiščenega tgE. Naveden je retencijski čas gE. B, Analiza hitrosti sedimentacije očiščenega proteina tgE. Sedimentacijski koeficient in molekulsko maso tgE smo določili z metodama c(s) in c(M) neodvisno. V (A) in (B) je tgE prikazan v črni barvi in ​​rdeč v modri barvi. C, Profili diferencialne skenirajoče kalorimetrije očiščenega proteina tgE in rgE.

Slika 3 Reaktivnosti tgE in rgE z mAbs. mAbs so serijsko razredčili in reagirali z obloženimi proteini tgE ali rgE v testu ELISA. Reakcije so bile odkrite s HRP-označenimi protimišjimi protitelesi. Podvojene vdolbinice so bile izmerjene na isti plošči za vsako razredčitev. Vrednosti EC50 so bile izračunane s prilagajanjem sigmoidnega trenda z uporabo programske opreme GraphPad Prism.

Slika 4 Imunogenost tgE in rgE, testirana pri miših BALB/c 1 teden po imunizaciji s tremi odmerki. A, Proizvodnja protiteles pri miših za tgE in rgE, formulirana z različnimi adjuvansi. B, Titri nevtralizirajočih protiteles pri miših za tgE in rgE, formulirana z različnimi adjuvansi. C in D, Vrednotenja gE specifičnih odzivov IFN- in IL-2, induciranih s cepivi tgE ali rgE.

Slika 5 Preskusi imunogenosti tgE cepiva, oblikovanega z aluminijem, pri miših BALB/c. A in B, obstojnost protiteles in nevtralizirajoči protitelesni odziv tgE/Al-001. Titre so spremljali do 16 tednov. C, ED50 pri miših za tgE in vodko, formuliran z aluminijem.

Ocena kandidata za cepivo tgE Zoster v primerjavi s cepivom Shingrix

Za primerjavo imunogenosti našega cepiva tgE s cepivom Shingrix smo liofiliziran protein tgE oblikovali z adjuvansom Shingrix, AS01B. Miši C57BL/6 smo imunizirali z dvema odmerkoma tgE/AS01B ali Shingrixa intramuskularno v mišico tibialis v tednih 0 in 4. Ravni protiteles po prvi imunizaciji kažejo, da je bila imunizacija s Shingrixom zadostna za induciranje visokih ravni protiteles anti-gE, znatno višji od tistih, ki jih proizvaja tgE/AS01B; po drugi imunizaciji pa ni bilo pomembne razlike v proizvodnji protiteles med obema skupinama (slika 6A). Kar zadeva ravni nevtralizirajočih protiteles, je imunizacija z enim odmerkom tgE/AS01B povzročila proizvodnjo zanemarljivih količin nevtralizirajočih protiteles, znatno nižjih od tistih, ki jih proizvaja Shingrix. Vendar pa spet po obnovitveni imunizaciji nismo opazili pomembne razlike v smislu proizvodnje nevtralizirajočih protiteles med obema skupinama (slika 6B). Da bi preverili, kako imunizacija vpliva na CMI, so bile po prvi in ​​drugi imunizaciji odkrite ravni gE-specifičnega IFN- in IL-2 z uporabo encimsko vezanega imunosorbentnega testa (ELISPOT) in obarvanja znotrajceličnih citokinov. Imunizacija s tgE/AS01B je povzročila slab humoralni imunski odziv v primerjavi z enim odmerkom cepiva Shingrix, vendar je pokazala primerljivo moč v smislu indukcije splenocitov, ki proizvajajo IFN- - in IL-2- (slika 6C). Po drugi imunizaciji so v skupini s tgE/AS01B v primerjavi s kontrolno skupino s fiziološko raztopino odkrili znatno število gE-specifičnih celic, ki proizvajajo citokine, ki so bile prav tako primerljive ali boljše od tistih v skupini Shingrix (slika 6D ). Podobne rezultate so opazili pri analizi pretočne citometrije, z opažanji podobnih deležev IFN- -celic CD4+ T, ki izražajo (slika 6E), IL-2-, ki izražajo CD4+ T celic (slika 6F) in celic T IFN- -CD8+ (slika 6G) med mišmi, imuniziranimi s tgE/AS01B in Shingrixom, ne glede na imunizacijo z enim ali poživitvenim odmerkom. Ti rezultati kažejo, da lahko protein tgE, pridobljen iz bakterijskega ekspresijskega sistema, inducira humoralni in celični imunski odziv, če je formuliran z ustreznimi adjuvansi, in se tako lahko obravnava kot kandidatni antigen za ustvarjanje cepiva proti VZV.

Slika 6 Imunogenost tgE pri miših C57BL/6. Dajali so odmerke 5 ug tgE, formuliranega s 50 μL adjuvansa AS01B. To je bila 1/10 odmerka cepiva Shingrix. Imunizacija je bila izvedena v tednih 0 in 4. A, Primerjava proizvodnje protiteles, inducirane s cepivom tgE/AS01B v primerjavi s cepivom Shingrix. Serumske titre smo določili s testom ELISA z uporabo plošč, prevlečenih z rgE. B, Primerjava odziva nevtralizirajočih protiteles na vOka po cepljenju s cepivom tgE/AS01B ali Shingrix. Nevtralizacijski titri antiseruma v 2. tednu (leva plošča) in 6. tednu (desna plošča) so izraženi kot recipročna vrednost razredčitve seruma, kar povzroči 50-odstotno inhibicijo. C, Vrednotenje gE-specifičnih odzivov IFN- in IL-2, induciranih s cepivom tgE/AS01B ali Shingrixom v 2. tednu. Število splenocitov, ki proizvajajo IFN- - in IL-2-, je bilo izračunano iz Test ELISPOT po ponovni stimulaciji s skupino gE peptidov. D, Vrednotenje gE-specifičnih odzivov IFN- in IL-2, induciranih s cepivom tgE/AS01B ali Shingrixom v 8. tednu. Število splenocitov, ki proizvajajo IFN- - in IL-2-, je bilo izračunano iz Test ELISPOT po ponovni stimulaciji s skupino gE peptidov. E–G, testi s pretočno citometrijo za celice CD4+ in CD8+, ki izražajo specifične citokine. Delež IFN- -celic CD4+ T, IL-2-CD4+ T celic, ki proizvajajo IFN- -CD8+ T celic celic med splenociti.

DISKUSIJA

VZV gE je glavna tarča humoralnega in celično posredovanega imunskega odziva med naravno okužbo z noricami in po cepljenju proti VZV Oka. Shingrix (GSK) je rekombinantno podenotno cepivo, ki vsebuje gE VZV, izražen v celicah CHO, in adjuvans AS01B na osnovi liposomov. Drugo delo je bilo namenjeno raziskovanju podenotnih cepiv proti HZ z uporabo gE proteinov, pridobljenih iz CHO ali celic žuželk, formuliranih z novimi adjuvansi (Cao et al., 2021; Lee et al., 2020; Luan et al., 2022a, Luan et al., 2022b; Wang et al., 2021; Wui et al., 2019; Wui et al., 2021). Tu smo raziskali in pokazali, da je gE protein mogoče topno eksprimirati in očistiti iz E. coli, nato pa formulirati kot kandidata za podenoto cepiva z ustreznim adjuvansom, da izzovemo ne samo močan nevtralizirajoči titer, ampak tudi močan odziv CMI.

rastlina cistanche krepi imunski sistem

E. coli kot ekspresijski sistem ponuja številne prednosti: hitro rast celic, poceni pogoje gojenja ter učinkovito in vsestransko orodje za proizvodnjo rekombinantnih proteinov. Raziskave antigenov, povezanih z virusom herpesa, so imele več uspehov z uporabo ekspresijskega sistema na osnovi E. coli. Nevtralizirajoči linearni epitop gE (aa 121–135) je bil spojen s 149 aa proteina jedra virusa hepatitisa B (HBc), da bi proizvedli himerne VLP, ki bi lahko induciral za VZV specifična nevtralizirajoča protitelesa pri miših (Zhu et al., 2016). V drugi študiji je bil homologni protein gE iz virusa Simian varicella (SVV) izražen v E. coli z uporabo fuzijske oznake GST za generiranje gE antiseruma (Gray et al., 2001). Zaenkrat ni bilo poročil o proteinu gE VZV brez fuzijske oznake, prečiščenega iz E. coli, kot kandidatu za cepivo.

gE je sestavljen iz treh regij: hidrofilne ektodomene 544-aa s signalnim peptidom (aa 1–30), hidrofobne transmembranske regije 17-aa in regije citoplazemskega repa 62-aa. Raziskali smo več kandidatnih molekul z različnimi okrnitvami na N- ali C-končnih regijah ektodomene gE in ugotovili, da je bila eksogena ekspresija teh proteinov v E. coli najboljša z uporabo okrnjenega dela (podatki niso prikazani). Nepoškodovana ektodomena gE brez fuzijske oznake se nagiba k tvorbi inkluzijskih telesc, ko jo izraža E. coli, in jo je težko očistiti. Med testiranimi kandidati za okrnitev je protein gE (aa 31–358) pokazal visoko topno ekspresijo z minimalnimi težavami pri čiščenju, pa tudi visoko čistost in visoko homogenost (slika 1). Tako je bil ta okrnjeni konstrukt ocenjen kot idealno kandidatno cepivo antigen. Ta strategija okrnitve bi lahko imela potencialni učinek na lastnosti proteina, zlasti na njegovo antigenost. Pred tem smo ekspresirali rekombinantni gE v celicah žuželk in ta konstrukt očistili za imunizacijo miši BALB/c, pri čemer smo pridobili 70 gE monoklonskih protiteles za analizo epitopa (Liu et al., 2015). Z našo analizo smo identificirali aa 1–194 kot imunodominantno regijo (podatki niso prikazani). Podobni rezultati so bili pridobljeni drugje, pri čemer gE-specifična mAbs kažejo na regije 109–123 in 160–316, ki so odgovorne za stabilno vezavo protiteles med variantnimi izolati (Vafai, 1994). V drugi študiji z uporabo rekombinantnih hibridnih fragmentov gE-VLP so avtorji identificirali ostanke 1–134 kot najbolj antigeno regijo proteina gE in pokazali, da C-terminal gE (ostanki 303–623), ki vsebuje več ostankov cisteina, ni uspel proizvesti delcev pri kvasovkah (Fowler et al., 1995), kar kaže, da bi morala heterologna ekspresija gE upoštevati ne le antigenost, temveč tudi enostavnost ekspresije. Tu smo optimizirali dolžino gE proteina za njegovo učinkovito topno izražanje z minimalnim zmanjšanjem antigenosti. TgE je pokazal podobno reaktivnost kot večina protiteles na sliki 3 kot rgE, proizveden v celicah žuželk, kar kaže, da so ključni epitopi dobro ohranjeni v proteinu tgE, očiščenem iz E. coli. Vendar pa je ena študija pokazala, da so bili imunodominantni epitopi CD4+ T celic, ki so jih prepoznali darovalci cepiva Shingrix, razpršeni po proteinu gE (Voic et al., 2020). Imunogenost tgE v naši študiji je bila identična tisti, ugotovljeni za gE, pridobljeno iz celic CHO v Shingrixu, ko je antigen kombiniran z adjuvansom AS01B, s podobno učinkovitimi humoralnimi odzivi in ​​odzivi CMI, kot je prikazano na sliki 5. Ti rezultati so pokazali, da okrnjeni gE izpeljana iz prokariontskega sistema, je bila v smislu antigenosti enako dobra kot nedotaknjena ektodomena gE iz evkariontskega sistema.

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

Obstajajo precejšnje razlike med proteini gE, pridobljenimi iz različnih ekspresijskih sistemov. Najpomembnejše razlike so opažene pri posttranslacijskih modifikacijah, zlasti pri glikozilaciji. O-povezani glikani iz membranskih glikoproteinov so pomembni v smislu prepoznavanja celic T in protiteles virusnih glikopeptidnih epitopov in to prepoznavanje ima potencial velikega biomedicinskega pomena pri naših poskusih posredovanja imunske zaščite pred virusi z uporabo podenotnih cepiv. Odstranitev glikanov v gE, proizvedenih v celicah CHO-K1, je povzročila 17-odstotno zmanjšanje reaktivnosti z VZV-pozitivnimi serumi. Nasprotno pa lahko O-glikozilacija moti imunoreaktivnost epitopov celic B: nekatere pomembne epitope blokirajo dodatni O-povezani glikani (Nordén et al., 2019). V naši študiji se zdi, da se tgE, ustvarjen iz E. coli, glede svoje imunoreaktivnosti in imunogenosti obnaša enako kot rgE, pridobljen iz celic žuželk, kar nakazuje, da je "goli" protein tgE obetaven kot kandidat za cepivo. Cepiva s tgE kot antigenom bodo verjetno povzročila ne le visoke titre IgG, kar kaže na njegov potencial kot podenotnega cepiva proti noricam brez potencialnega tveganja latence virusa, ampak tudi visok CMI, kar kaže na njegov potencial tudi kot cepivo proti herpesu. Na splošno antigen gE, pridobljen iz bakterijskega ekspresijskega sistema v tej študiji, ponuja veliko bolj ekonomično strategijo za razvoj cepiv proti VZV.

Reference

Adkins, JC, in Wagstaff, AJ (1998). Rekombinantno cepivo proti hepatitisu B: pregled njegove imunogenosti in zaščitne učinkovitosti proti hepatitisu B. Biodrugs 10, 137–158.

Arvin, AM (1992). Celično posredovana imunost na virus varicella-zoster. J Infect Dis 166, S35–S41.

Cao, H., Wang, Y., Luan, N. in Liu, C. (2021). Imunogenost glikoproteina E virusa varicella-zoster, formuliranega z lipidnimi nanodelci in nukleinskimi imunostimulatorji pri miših. Cepiva 9, 310.

Chen, L., Liu, J., Wang, W., Ye, J., Wen, L., Zhao, Q., Zhu, H., Cheng, T. in Xia, N. (2014). Razvoj nevtralizacijskega testa virusa varicella-zoster z uporabo encimsko vezanega imunosorbentnega točkovnega testa protiteles proti glikoproteinu K. J Virol Methods 200, 10–14.

Cohen, JI (2013). Klinična praksa: herpes zoster. N Engl J Med 369, 255– 263. Dendouga, N., Fochesato, M., Lockman, L., Mossman, S., in Giannini, SL (2012). Celično posredovani imunski odzivi na cepivo proti glikoproteinu E proti virusu varicella-zoster z uporabo agonista TLR in QS21 pri miših. Vaccine 30, 3126–3135.

Fowler, WJ, Garcia-Valcarcel, M., Hill-Perkins, MS, Murphy, G., Harper, DR, Jeffries, DJ, Burns, NR, Adams, SE, Kingsman, AJ, in Layton, GT (1995). Identifikacija imunodominantnih regij in linearnih epitopov celic B proteina ovojnice gE virusa varicella-zoster. Virologija 214, 531–540.

Galea, SA, Sweet, A., Beninger, P., Steinberg, SP, LaRussa, PS, Gershon, AA, in Sharrar, RG (2008). Varnostni profil cepiva proti noricam: 10-letni pregled. J Infect Dis 197, S165–S169.

Gray, WL, Mullis, LB, in Soike, KF (2001). Izražanje glikoproteina virusa Simian varicella E. Virus Res 79, 27–37.

Heininger, U. in Seward, JF (2006). norice. Lancet 368, 1365–1376.

Kim, JY, Kim, YG, in Lee, GM (2012). Celice CHO v biotehnologiji za proizvodnjo rekombinantnih proteinov: trenutno stanje in nadaljnji potencial. Appl Microbiol Biotechnol 93, 917–930.

Lal, H., Cunningham, AL, Godeaux, O., Chlibek, R., Diez-Domingo, J., Hwang, SJ, Levin, MJ, McElhaney, JE, Poder, A., Puig-Barberà, J., et al. (2015). Učinkovitost cepiva proti podenoti herpesa zostra z adjuvansom pri starejših odraslih. N Engl J Med 372, 2087–2096.

Lee, SJ, Park, HJ, Ko, HL, Lee, JE, Lee, HJ, Kim, H., in Nam, JH (2020). Vrednotenje podenote glikoproteina E in živih oslabljenih cepiv proti virusu varicella-zoster, formuliranih z adjuvansom na osnovi enoverižne RNA. Immun Inflamm Dis 8, 216–227.

Liu, J., Zhu, R., Ye, X., Yang, L., Wang, Y., Huang, Y., Wu, J., Wang, W., Ye, J., Li, Y., et al. (2015). Kvantitativni test VZV glikoproteina E na osnovi monoklonskih protiteles in njegova uporaba pri kvantitaciji antigena v cepivu VZV. Appl Microbiol Biotechnol 99, 4845–4853.

Luan, N., Cao, H., Wang, Y., Lin, K. in Liu, C. (2022a). Ionizirajoči lipidni nanodelci so okrepili sinergistični adjuvantni učinek CpG ODN in QS21 v cepivu proti glikoproteinu E podenote proti virusu noric in pasavca. Farmacevtika 14, 973.

Luan, N., Cao, H., Wang, Y., Lin, K. in Liu, C. (2022b). Glikoprotein E virusa varicella-zoster z adjuvansom LNP-CpG ODN je povzročil primerljive ravni imunosti s Shingrix™ pri miših, zdravljenih z VZV. Virol Sin 37, 731–739.

Monie, A., Hung, CF, Roden, R. in Wu, TC (2008). Cervarix: cepivo za preprečevanje HPV 16, 18-povezanega raka materničnega vratu. Biologija 2, 97–105.

Nordén, R., Nilsson, J., Samuelsson, E., Risinger, C., Sihlbom, C., Blixt, O., Larson, G., Olofsson, S., in Bergström, T. (2019). Rekombinantni glikoprotein E virusa varicella-zoster vsebuje glikansko-peptidne motive, ki modulirajo epitope B celic v diskretne imunološke podpise. Int J Mol Sci 20, 954.

Oliver, SL, Yang, E. in Arvin, AM (2016). Glikoproteini virusa Varicella-zoster: vstop, replikacija in patogeneza. Curr Clin Microbiol Rep 3, 204–215.

Overton, TW (2014). Proizvodnja rekombinantnih beljakovin v bakterijskih gostiteljih. Drug Discov Today 19, 590–601.

Oxman, MN, Levin, MJ, Johnson, GR, Schmader, KE, Straus, SE, Gelb, LD, Arbeit, RD, Simberkoff, MS, Gershon, AA, Davis, LE, et al. (2005). Cepivo za preprečevanje herpesa zostra in postherpetične nevralgije pri starejših odraslih. N Engl J Med 352, 2271–2284.

Shah, RA, Limmer, AL, Nwannunu, CE, Patel, RR, Mui, ZN, in Tyring, SK (2019). Shingrix za herpes zoster: pregled. Skin Therapy Lett 24, 5–7. Singh, SM, in Panda, AK (2005). Solubilizacija in ponovno zlaganje proteinov bakterijskih inkluzijskih telesc. J Biosci Bioeng 99, 303–310.

Syed, YY (2018). Rekombinantno cepivo proti pasavcu (Shingrix®): pregled pri herpesu zostru. Droge Staranje 35, 1031–1040.

Takahashi, M., Otsuka, T., Okuno, Y., Asano, Y., Yazaki, T., in Isomura, S. (1974). Živo cepivo se uporablja za preprečevanje širjenja noric pri otrocih v bolnišnicah. Lancet 304, 1288–1290.

Tseng, HF, Smith, N., Harpaz, R., Bialek, SR, Sy, LS, in Jacobsen, SJ (2011). Cepivo proti herpesu zoster pri starejših odraslih in tveganje za poznejšo bolezen herpes zoster. JAMA 305, 160–166.

Vafai, A. (1994). Mesta za vezavo protiteles na skrajšanih oblikah gpI(gE) glikoproteina virusa varicella zoster. Vaccine 12, 1265–1269.

Voic, H., de Vries, RD, Sidney, J., Rubiro, P., Moore, E., Phillips, E., Mallal, S., Schwan, B., Weiskopf, D., Sette, A., et al. (2020). Identifikacija in karakterizacija epitopov T celic CD4+ po cepljenju s Shingrixom. J Virol 94, e01641-20.

Wang, Y., Qi, J., Cao, H. in Liu, C. (2021). Imunski odzivi na glikoprotein E virusa varicella-zoster, formuliran z nanodelci poli(mlečne-koglikolne kisline) in adjuvansi nukleinske kisline pri miših. Virol Sin 36, 122–132.

Wu, T., Li, SW, Zhang, J., Ng, MH, Xia, NS, in Zhao, Q. (2012). Razvoj cepiva proti hepatitisu E: 14-letna odisejada. Hum Vaccin Immunother 8, 823–827.

Wui, SR, Kim, KS, Ryu, JI, Ko, A., Do, HTT, Lee, YJ, Kim, HJ, Lim, SJ, Park, SA, Cho, YJ, et al. (2019). Učinkovita indukcija celično posredovane imunosti na glikoprotein E virusa varicella-zoster, liofiliziran s kationskim adjuvansom na osnovi liposomov pri miših. Vaccine 37, 2131–2141.

Wui, SR, Ko, A., Ryu, JI, Sim, E., Lim, SJ, Park, SA, Kim, KS, Kim, H., Youn, H., in Lee, NG (2021). Učinek agonista TLR4/kationskega liposomskega adjuvansa na učinkovitost cepiva proti glikoproteinu E proti virusu varicella-zoster: predstavitev antigena, privzem in dostava v bezgavke. Farmacevtika 13, 390.

Zerboni, L., Sen, N., Oliver, SL, in Arvin, AM (2014). Molekularni mehanizmi patogeneze virusa varicella zoster. Nat Rev Microbiol 12, 197–210.

Zhu, R., Liu, J., Chen, C., Ye, X., Xu, L., Wang, W., Zhao, Q., Zhu, H., Cheng, T. in Xia, N. (2016). Visoko ohranjen epitop-kandidat za cepivo proti virusu varicella-zoster inducira nevtralizirajoča protitelesa pri miših. Vaccine 34, 1589–1596.