Tubulozid B iz Cistanche Salsa rešuje nevronske celice PC12 pred apoptozo in oksidativnim stresom, ki ju povzroča 1-metil-4-fenilpiridinijev ion

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

Guoqing Zheng, Xiaoping Pu, Li Lei, Pengfei Tu, Changling Li

Povzetek:

Nevroprotektivnoučinki tubulozida B iz cistanhe, eden izmed feniletanoidov, izoliran pri Kitajcihzeliščno zdravilo Cistanche salsa, na 1-metil-4-fenilpiridinijevem ionu (MPP plus ) so raziskovali apoptozo in oksidativni stres v nevronskih celicah PC12. Celice PC12, obdelane z MPP ＋, so bile podvržene apoptotični smrti, kot je bilo ugotovljeno s testom MTF, pretočno citometrijo in elektroforezo v agaroznem gelu DNA; znotrajcelično kopičenje reaktivnih kisikovih vrst (ROS) je bilo izmerjeno z barvanjem DCFH-DA z lasersko skenirajočo konfokalno mikroskopijo (LSCM). Hkratno zdravljenje s tuhulozidom B je izrazito oslabilo citotoksičnost, povzročeno z MPP＋, fragmentacijo DNA in znotrajcelično kopičenje ROS. Ti rezultati močno kažejo, da tubulozid B preprečuje MPP-inducirano apoptozo in oksidativni stres. Tubulozid B se lahko uporablja kotproti Parkinsonovi boleznizastopniki.

Uvod

Patološko je za sporadično Parkinsonovo bolezen (PD) značilna izguba kateholaminergičnih nevronov, zlasti dopaminergičnih nevronov substantia nigra pars compacta (SNc), in prisotnost značilnega intraneurona| vključki, imenovani Lewyjeva telesca v prizadetih predelih možganov. Kljub številnim dejavnikom, ki so bili vpleteni v patogenezo PB, ostajajo mehanizmi, ki sodelujejo pri začetku in napredovanju PB, negotovi. Čeprav odgovor na vzrok PB še ni pojasnjen, več vrst dokazov močno kaže na vpletenost oksidativnega stresa, ki končno vodi do nevronske smrti ali apoptoze zaradi čezmernega nastajanja prostih radikalov [1], [2], [3]. Dejstvo, da lahko nigral dopaminergični sistem proizvede visoke ravni prostih radikalov in ima relativno nizke ravni antioksidativnega obrambnega sistema, dodatno podpira to hipotezo. Študije in vivo in in vitro so pokazale nevrotoksičnost MPP＋, ki jo povzroča oksidativni stres, aktivnega metabolita l-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) na dopaminergične nevrone [4]. ], [5]. Vpletenost prostih radikalov, ki jih prekomerno proizvaja oksidativni stres, kot neposrednega vzroka nevrodegenerativnih motenj, kot je PD, kaže na ključno vlogo antioksidantov. Tubulozid B (slika 1) je bila ena od feniletanoidnih spojin, izoliranih iz stebelCistanche salsa. Prejšnje študije so pokazale, da številni feniletanoidi, vključno s tubulozidom B, kažejo močno aktivnost lovljenja prostih radikalov [6], [7].

Ob upoštevanju teh ugotovitev smo v tej študiji raziskali učinek tubu]nside B na nevrotoksičnost, povzročeno z MPP plus in vitro, z uporabo celične linije feokromocitoma simpatičnega živca PC12, ki je bila v preteklih letih uspešno uporabljena za preučevanje delovanja nevronov [8], [9].

anti-parkinsonova bolezen:cistanche

Materiali in metode

Materiali

Tubulozid B izCistanche salsaje prijazno dobavil dr. Li Lei (Oddelek za naravne izdelke, Fakulteta za farmacevtske vede, Univerza v Pekingu, Peking, Kitajska). Čistost spojine je bila z analizo HPLC več kot 98 odstotkov. Dulbeccov modificirani Eagleov medij (DMEM), konjski serum in fetalni telečji serum so bili kupljeni pri GIBCO BRL, 1-metil~-fenilpiridinijev ion (MPP plus), poli-L-lizin, 3-(4, 5 -dimetiltiazol-2 -il)-2,5- difeniltetrazolijev bromid (MTT), propidijev jodid (PI), RNaza A, proteinaza K in 2;7'-diklorofluorescein diacetat (DCFH-DA) so bili kupljeni pri Sigmi.

Kultura celic

Celice PCI2 smo vzdrževali v DMEM, dopolnjenem z 10 odstotki konjskega seruma, 5 odstotki fetalnega telečjega seruma, 100 U/ml penicilina in 100 ug/ml streptomicina. Celice so bile gojene v navlaženem inkubatorju, prezračenem s 95 odstotki zraka in 5 odstotki CO2 pri 37 stopinjah. Vsi poskusi so bili izvedeni 24-48 h po zasejanju celic. Celice smo rutinsko pobrali s 0,25-odstotnim tripsinizacijo, ko so se celice približale subkonfluentni stopnji, in nasadili v 25 cm bučke za kulturo, razdeljene v razmerju 1:8.

Analiza viabilnosti celic

Preživetje celic je bilo določeno z uporabo modificiranega testa MTT, kot je opisano prej [10]. Na kratko, celice PC12 so bile zasejane v 96-plošče z vdolbinicami pri gostoti 1 × 104 celic na vdolbinico. Kulture smo gojili 48 ur, nato pa smo medij spremenili v medij, ki je vseboval različne koncentracije tubulnzida B ali MPP＋. Po inkubaciji do 48 h in 72 h smo v plošče z vdolbinicami dodali raztopino MTr (5 mg/ml v DMEM) in celice pustili inkubirati 4 ure pri 37 stopinjah. Ko smo medij odstranili, smo celice in kristale barvila raztopili z dodatkom 200 μL DMSO in izmerili absorpcijo pri 570 nm (540 nm kot referenca) z bralnikom mikroplošč modela 550 (Bio-Rad). Viabilnost celic je bila analizirana tudi z metodo izključitve tripanskega modrega. Celice smo zbrali, nežno peletirali in obarvali z 0,6-odstotno raztopino tripan modrega za 3 dežja. Odstotek neobarvanih celic je bil nato ocenjen v desetih naključno izbranih mikroskopskih poljih. Kot pozitivno zdravilo je bilo uporabljeno 100 ng／ml epidermalnega rastnega faktorja (EGF).

Odkrivanje apoptoze s pretočno citometrijo

Apoptotične celice so bile odkrite s pretočno citometrijo z uporabo propidijevega jodida (PI) [11]. Na kratko, približno 1 × 106 celic, inkubiranih s preskusnimi snovmi, smo pobrali s centrifugiranjem in jih enkrat sprali s PBS. Celice smo fiksirali s 70 odstotnim etanolom 24 ur pri - 20 stopinjah in enkrat sprali s PBS. Celice smo nato resuspendirali v 300 μL PBS, ki je vseboval 0,5 mg/ml RNaze in 0,5 mg/ml PI. Po nadaljnji inkubaciji 30 minut v temi smo izvedli pretočno citometrijo s FACScan (Becton Dickinson, Heidelberg, Nemčija).

Uporabili smo Moorov protokol [12], ki je izoliral samo fragmentirano DNK, poskuse pa smo normalizirali z uporabo enakega števila kultur iz vsake testne skupine. Na kratko, 3 × 106 nevronov iz vsakega od obdelanih vzorcev smo sprali v Hankovi uravnoteženi raztopini soli (1000g za 10 minut) in pelete, nastale na dnu epruvete, homogenizirali z 1 ml liznega pufra (10 mM Tris pri pH 7,4. 5 mM EDTA, 1 odstotek Tritona X-100) 20 minut na ledu. Po centrifugiranju pri 11,000 g za 20 dežja pri 4 stopinjah smo supernatante, ki so vsebovali fragmentirano DNA, odstranili in razgradili z 20 mg/ml RNaze A pri 37 stopinjah 1 uro in 0,1 mg/ml proteinaze K pri 56 stopinjah za dodatno 1 uro. Fragmentirano DNA smo ekstrahirali s fenolom in kloroformom ter centrifugirali pri 10,000g za 1 dež pri 4 C. Vodno fazo smo prenesli v novo Eppendorfovo epruveto, zmešali z 2 volumnima ledeno mrzlega etanola in nato postavite na -20 stopinjo za vsaj 1 uro, da oborite DNK. Po centrifugiranju pri 15,{38}}g 20 minut pri 4 stopinjah smo supernatante odstranili in pelete DNA enkrat sprali z 80 odstotki etanola (15.000 g 15 minut pri 4 stopinjah), posušili na zraku in raztopili v 20 μL TE pufra pri pH 7,6. Celoten vzorec smo nato podvrgli elektroforezi na 1,5-odstotnem agaroznem gelu 1 uro pri 85 V. Gel smo pregledali in fotografirali z Ultra Violet Products Gel Documentation System (GELDOC-2000, Bio-Rad, ZDA).

Merjenje znotrajcelične tvorbe ROS

Tvorba znotrajceličnih peroksidov je bila odkrita s konfokalnim skenirnim laserskim mikroskopom z uporabo nefluorescentne spojine, 2"7"-diklorofluorescein diacetata (DCFH-DA) [13], ki je v celicah zaestrena z endogenimi esterazami v ionizirano prosto kislino, 2 ;7"-diklorofluorescein. 2",7-Diklorofiuorescin lahko hidroantioksidanti oksidirajo v fluorescentni 2"7"-diklorofluorescein (DCF). Celice smo inkubirali z 10 μM DCFH-DA 30 minut pri 37 stopinjah. Kulture smo dvakrat sprali s Hankovo ​​uravnoteženo raztopino soli in slikali v istem mediju. Slikanje je bilo opravljeno z uporabo konfokalnega skenirnega laserskega mikroskopa, DCF je bil vzbujen pri 488 nm, emisijski filter pa je bil pregradni filter 510 nm. Da bi zagotovili veljavno primerjavo, so bili za vsa opazovanja uporabljeni isti parametri pridobivanja. Nastavljen je bil optimalni navpični položaj na sredini celic, nato pa je bilo polje hitro skenirano. Ker je osvetlitev pri vzbujevalni valovni dolžini 488 nm povzročila povečano fluorescenco zaradi oksidacije tega barvila, je bilo vsako polje izpostavljeno svetlobi natanko enak čas. Izhodiščne vrednosti iz nestimuliranih celic so bile uporabljene kot kontrolne vrednosti za primerjavo s celicami, obdelanimi z MPP v prisotnosti ali odsotnosti tubulozida B. Po skeniranju je bila povprečna relativna intenzivnost fluorescence v 15-20 telesih nevronskih celic na polje mikroskopa kvantificirana v štirih ločene kulture glede na stanje zdravljenja.

cistanche

Statistična analiza

Vse dobljene vrednosti so bile izražene kot srednje vrednosti ±SD. Statistično pomembnost razlik med skupinami smo določili s Studentovim t-testom; Izračunane vrednosti p, manjše od 0,05, so veljale za statistično pomembne.

Rezultati

Kot je prikazano na sliki 2, je MPP plus povzročil od odmerka odvisno zmanjšanje viabilnosti celic PCI2. V nasprotju s tem pa je EGF, dobro znani nevrotrofni faktor, povzročil znatno zaščito viabilnosti celic pri 100 ng/ml MPP＋-inducirani citotoksični učinki so bili oslabljeni tudi v prisotnosti tubulozida B (5, 10, 50 ali 100 ug-ml-1 ), čeprav z manjšo močjo kot referenčno zdravilo (slika．3). Tubulozid B je pri teh koncentracijah pokazal citoprotektivne učinke na način, ki je bil odvisen od odmerka, sama spojina pa ni povzročila nobene očitne citotoksičnosti (podatki niso prikazani). Gel elektroforeza izvlečka DNA iz celic PCI 2, obdelanih z 200 µM MPP plus 48 ur, je pokazala DNA laddering. klasična značilnost apoptoze, tubulozid B, je pri odmerkih 10 in 100 µg·ml-1povzročil nastanek lestve DNK (slika．4).．Slika．5 prikazuje tipične histograme pretočne citometrične analize apoptotične celične smrti, inducirane z MPP＋ v celicah PC12 v prisotnosti ali odsotnosti tubulozida B．Kvantitacija profila celičnega cikla s PI je pokazala število celic s subdiploidnimi značilnostmi (regija M1), ki kažejo na apoptotično fragmentacijo DNA． V neobdelanih celicah je bila apoptotična subdiploidna frakcija minimalna do 5．94％od skupno 10000 celic (slika．5 A). Po 48-urni izpostavljenosti MPP＋ se je odstotek apoptoze povečal na 43．02;j;(slika．5 B)． Ko je bil dodan celični kulturi, je tubulozid B zaviral MPP＋inducirano apoptozo na način, ki je odvisen od odmerka. Pri koncentraciji 10 ug·ml-1zaščita s tubulozidom B ni bila statistično značilna, pri 50 in 1 00ug·ml-1 pa je prišlo do zmanjšanja za 45% in 63% opazili, kar je povzročilo povečanje odstotka preživetih celic (slika．5D, E).

Kopičenje intracelularnih ROS je mogoče odkriti z uporabo DCFH—DA．Celice PC12, obdelane z 200 uM MPP＋ 48 ur, so pokazale intenzivno fluorescenco znotraj celice po obarvanju z barvilom DCFH-DA (slika．6)． Hkratno zdravljenje s tubulozid B (v odmerkih 10 in 100 ug·ml) je zaviralo MPP＋一 inducirano proizvodnjo ROS (zmanjšan odstotek je bil 24．52％ oziroma 55．63％)．

Diskusija

Patogeneza PD vključuje močan oksidativni stres, zmanjšano raven antioksidantov in mitohondrijske okvare. za vse je znano, da inducirajo apoptozo v več celičnih sistemih. Zlasti je bilo dokazano, da prosti radikali sprožijo aktivno celično smrt v nevronih [14]. MPTP povzroči ireverzibilen in hud parkinsoniji podoben sindrom, ki povzroči selektivno degeneracijo nigrostriatalnih dopaminergičnih nevronov pri ljudeh. Ta nevrotoksin je bil uporabljen za ustvarjanje živalskih modelov PD[15].MPTP se pretvori z monoaminooksidazo B v MPP＋, ki se kopiči v mitohondrijih． kjer zavira mitohondrijski kompleks I in te mitohondrijske dni． funkcija povzroči apoptozo [16]．Zato se nevrotoksičnost, ki jo povzroča MPP plus 一 v dopaminergičnih nevronih, v veliki meri uporablja kot etiološki model PD za presejanje nevroprotektivnih učinkovin.

V tej študiji smo dokazali, da je tubulozid B zmanjšal celično smrt, povzročeno z MPP plus prek oksidativnega stresa v celicah PC12. Nadalje smo dokazali, da je tubulozid B v odvisnosti od odmerka zaščiten tudi pred laddingom DNA, ki ga povzroča MPP plus in apoptozo, izmerjeno z elektroforezo v DNA gelu in pretočno citometrično analizo. Poleg tega je sočasno zdravljenje z višjimi koncentracijami tubulozida B zaviralo proizvodnjo ROS, ki jo povzroča MPP. Tako je tubulozid B pokazal večnamenske nevroprotektivne učinke. V delovanje tubulozida B je lahko vključenih več mehanizmov, ločeno ali skupaj. Antioksidativni učinek je možen mehanizem za nevroprotekcijo, ki jo posreduje tubulozid B. Xiong Q je ugotovil, da je tubulozid B pokazal močno aktivnost lovljenja prostih radikalov na 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil radikal in ksantin]ksantin oksidazo, ki ga generira superoksidni anionski radikal [6].

Pred kratkim so poročali, da imajo številni feniletanoidi lastnosti lovljenja prostih radikalov in ščitijo toksične poškodbe, ki jih povzroča oksidativni stres. ROS, ki jih proizvaja MPP plus, kot so vodikov peroksid, superoksidni anion in hidroksilni radikal, zlahka poškodujejo biološke molekule, kar lahko na koncu povzroči apoptotično ali nekrotično celično smrt. Tako ima lahko tubulozid B neposredne čistilne učinke proti ROS. Čeprav naši podatki ne določajo natančnega mesta, na katerem tubulozid B deluje za zaviranje kopičenja ROS, kažejo, da nevroprotektivni mehanizem vključuje stimulacijo poti antioksidantov. Študija molekularne strukture tubulozida B tudi kaže, da ima močno sposobnost čiščenja prostih radikalov (osebna komunikacija).

Ustrezni so lahko tudi drugi mehanizmi. Na primer, tubulozid B ima lahko sposobnost preprečiti toksičnost MPP＋ z zaviranjem odpiranja mitohondrijske prepustnosti prehodnih por in disfunkcije. Poleg tega je treba upoštevati tudi, ali ima tubulozid B neposreden učinek na pospeševanje rasti nevronskih celic. Natančen mehanizem nevroprotektivnega delovanja tubulozida B ostaja nejasen. Za pojasnitev celotne slike njegovega nevroprotektivnega učinka so potrebne dodatne študije.

Končno ima tubulozid B iz ekstrakta Cistanche salsa očitne zaščitne učinke na apoptozo in oksidativni stres, ki ju povzroča MPP plus. Njegovi nevroprotektivni učinki proti toksičnosti MPP ＋ so lahko pomembni in kažejo, da ima lahko terapevtski potencial pri preprečevanju in zdravljenju PD.

zdravljenje PD: cistanche

Reference

7. Xiong Q, Tezuka Y, Kaneko 1", Li H, Tran LQ Hase K, Namba T, Kadota S. Inhibicija dušikovega oksida s feniletanoidi v aktiviranih makrofagih. Eur J Pharmaco12000; 400:137 –44

8. Greene LA, Tischler AS. Vzpostavitev noradrenergične klonske linije celic nadledvičnega feokromocitoma, ki se odzivajo na rastni faktor živcev. Proc Nat Acad Sci 1976; 73:2424-8

9. Yao Z, Drieu K, Szweda LI, Papadopoulos V. Prosti radikali in peroksidacija lipidov ne posredujejo pri smrti nevronskih celic, ki jo povzroča amiloid. Brain Res 1999; 847: 203- 10

10. Yamamoto T, Yuyama K, Nakamura K, Kato T, Yamamoto H. Kinetična karakterizacija toksičnosti dušikovega oksida za celice PC12: učinek razpolovnega časa sproščanja NO. Eur J Pharmacol 2000; 397:25-33

11. Nicoletti l, Migliorati G, Pagliacci MC, Grignani E Riccardi C. Hitra in preprosta metoda za merjenje apoptoze timocitov z barvanjem s propidijevim jodidom in pretočno citometrijo. J Immunol Methods 1991; 139: 271-9

12. Moore KJ, Matlashewski C. Znotrajcelična okužba z Leishmania do nova zavira apoptozo makrofagov. J Immunol 1994; 152: 2930- 7

13. Mark RJ, Keller JN, Kruman I, Mattson MP. Osnovni FGF oslabi z amiloidnim peptidom povzročen oksidativni stres, mitohondrijsko disfunkcijo in oslabitev aktivnosti Na ＋-K ＋-ATPaze v hipokampalnih nevronih. Brain Research 1997; 756: 205-14

14. Merad-Boudia M, Nicole A, Santiard-Baron D, Saille C, CeballosPicot L Mitohondrijska okvara kot zgodnji dogodek v procesu apoptoze, ki jo povzroča izčrpavanje glutationa v nevronskih celicah: pomen za Parkinsonovo bolezen. Biochem Pharmaco11998; 56: 645-55

15. Langston JW, Ballard P, Tetrud JW, Irwin I. Kronični parkinsonizem pri ljudeh zaradi produkta sinteze analoga meperidina. znanost 1983; 219:979-80

16. Mizuno Y, Sone N, Suzuki K, Saitoh T. Študije o toksičnosti 1-metil-4-fenilpiridinijevega iona (MPP ＋) proti mitohondrijem mišjih možganov.J Neurol Sci 1988; 86: 97-110