Dva človeška presnovka rešujeta C. Elegansov model Alzheimerjeve bolezni prek citosolnega razvitega proteinskega odziva

S starostjo povezane spremembe v celičnem metabolizmu lahko vplivajo na homeostazo možganov in ustvarjajo pogojeki dopuščajo nastanek in napredovanje nevrodegenerativnih motenj, kot je npr Alzheimerjeva bolezen's in Parkinson's boleznimi. Čeprav so bile vloge metabolitov obsežneproučevali v zvezi s celičnimi signalnimi potmi, ostajajo njihovi učinki na agregacijo beljakovin relativno neraziskani. Z računalniško analizo baze podatkov o človeškem metabolomusmo identificirali dva endogena metabolita, karnozin in kinurensko kislino, ki zavirata agregacijo amiloidnega beta peptida (A ) in reševanje aC. elegansmodel odAlzheimerjeva bolezen's boleznijo. Ugotovili smo, da ti metaboliti delujejo tako, da sprožijo citosolno razvit proteinodziv prek transkripcijskega faktorja HSF-1 in spodnjih spremljevalcev HSP40/Jproteina DNJ-12 in DNJ-19. Ti rezultati pomagajo racionalizirati prejšnja opažanja v zvezimožne koristi teh metabolitov proti staranju z zagotavljanjem mehanizma za njihovo delovanje. Skupaj našeugotovitvezagotavljajo povezavo med presnovno homeostazo inhomeostazo beljakovin, kar bi lahko spodbudilo preventivne posege protinevrodegenerativne motnje.

Kliknite tukaj, če želite izvedeti več o tem, kako Cistanche preprečujeAlzheimerjeva in Parkinsonova bolezen

Vprašaj za več:

E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plus 86 15292862950

Alzheimer'Bolezen (AD) je kompleksna motnja, za katero je značilna prisotnost nenormalnih beljakovinskih usedlin v možganskih tkivih1–3. Čeprav molekularni izvor te bolezni še ni znantrdnoUgotovljeno je, da je splošno znano, da je prisotnost beljakovinskih usedlin povezana z disregulacijo mreže proteinske homeostaze4,5. Ta sistem je del širšega sistema celične homeostaze, ki vključuje številne druge komponente, vključno s sistemom metabolitne homeostaze6,7. Metaboliti vplivajo na ključne korake v celičnih poteh, kjer delujejo kot substrati za encime ali kot signalne molekule za aktivacijo biokemičnih poti. Na primer, omejitev kalorij in občasno postenje zavirata strukturni in funkcionalni upad med staranjem pri laboratorijskih glodalcih in opicah8–10. 

Poleg tega so se razvile signalne poti, da se odzovejo na celične strese vstaranje, pri čemer sta poti AMPK in mTOR široko raziskani pri celičnem razvoju in staranju11–14. Zato je pomembno razumeti, kako so nevrodegenerativne motnje, povezane s staranjem, kot je AD, povezane z aberacijami v celični homeostazi. Posebna hipoteza, ki jo tukaj raziskujemo, je, ali je disregulacija ravni metabolitov povezana z nenormalno agregacijo beljakovin v AD. Temu se približamo s testiranjem, ali lahko dodajanje disreguliranih metabolitov prepreči ali odpravi agregacijo napačno zvitih beljakovin. Okvara različnih bioloških procesov prispeva k nastanku in napredovanjuAD, vključno s popravljanjem DNK, vflflvnetje, mitohondrijsko delovanje, oksidativni stres, vzdražnost nevronske mreže, homeostaza kovinskih ionov, avtofagija, regulacija hipotalamusa, nevrogeneza odraslih in homeostaza beljakovin (sl.1)1,15–28. Presnovki majhnih molekul igrajo ključno vlogo v teh biokemičnih procesih, vendar še vedno ni natančno znano, katere od teh vlog soprvineregulirani in so povezani s patofiziološkim nastankom in napredovanjem bolezni. V tem kontekstu še ni jasno, ali je pojav napačnega zlaganja in agregacije beljakovin vzrok ali posledica okvare teh bioloških procesov.trdnoustanovljena. Številne študije so pokazale, da lahko agregacija beljakovin neposredno povzroči aktivacijo spodnjih biokemičnih kaskad, ki pomenijofifine more pospešiti patologije AD29. Vrste strupenih agregatov so priznane kot A in Tau oligomere, katerih nenormalna interakcija s celičnimi komponentami lahko okvari nevronske funkcije29,30. Glede na naše trenutno razumevanje AD lahko upočasnitev ali zaviranje agregacije beljakovin prispeva k preprečevanju napredovanja bolezni. Tako lahko razumevanje, katere poti prispevajo k temu cilju, ponudi vpogled v priložnosti za preventivne in terapevtske posege ter zagotovi smernice za trajnostne načine življenja (npr. dejavniki življenjskega sloga, vadba in prehrana), ki zavirajoADin promoviratizdravo staranje.

Slika 1 Homeostaza presnove in homeostaza beljakovin vAlzheimerjeva bolezen's bolezen (AD). a AD je povezan s širokim razponom disfunkcij v celični homeostazi (barvna polja). Različni endogeni metaboliti so vključeni v uravnavanje teh celičnih procesov (vstavki sivega polja).b Majhna molekulaendogeni metaboliti lahko modulirajo procese agregacije beljakovin, povezane z boleznijo. Z načrtovanjem sistematičnih študij lahko odkrijemo natančne molekularne mehanizme, s katerimi uravnavajo homeostazo beljakovin.

in napačno zlaganje ter odzivi na nezvite proteine ​​(UPR) v endoplazmatskem retikulumu in mitohondrijih31,32. Številni proteini toplotnega šoka iz HSR so molekularni spremljevalci, ki usmerjajo konformacijo proteinov med biogenezo in preprečujejo napačno zlaganje in agregacijo, ki moti celično delovanje21. Ker je citoplazma tudi skupek različnih metabolitov, ki se proizvajajo in prenašajo po biokemičnih omrežjih, je pričakovati, da lahko njihove ravni in mejne koncentracije v celici delujejo kot regulatorji majhnih molekul na mrežo homeostaze beljakovin, s čimer ohranjajo beljakovine, nagnjene k agregaciji, v njihovo topno stanje. Patel in sodelavci so pokazali, da ATP poveča topnost beljakovin pri fizioloških koncentracijah (razpon mM)33. Tako lahko predvidevamo, da lahko tudi drugi endogeni metaboliti prispevajo k modulaciji agregacije beljakovin. Izkazalo se je, da povečana ekspresija molekularnih spremljevalcev, ki jo primarno uravnava transkripcijski faktor faktor toplotnega šoka 1 (HSF-1), obnavlja homeostazo beljakovin v različnih modelih bolezni z napačnim zvijanjem beljakovin, kar kaže, da ta mehanizem lahko predstavlja obetaven cilj za preventivne in terapevtske pristope34. Calamini et al. identificiral nove razrede regulatorjev homeostaze proteinov z majhnimi molekulami, ki inducirajo HSF1-odvisno ekspresijo spremljevalca in obnovijo zvijanje proteinov v več modelih konformacijskih bolezni proteinov. Te ugodne učinke na stabilnost proteoma posredujejo HSF1, FOXO, NRF2 in mehanizem spremljevalca34. Pravzaprav so tudi endogeni metaboliti majhne molekule, ki uravnavajo ključne biološke procese. Ker se ravni teh metabolitov lahko spremenijo kot odziv na okoljske znake, je pomembno razumeti njihove neposredne učinke na homeostazo beljakovin. V tem delu smo se vprašali, ali lahko endogeni metaboliti vplivajo na agregacijo beljakovin ali ne, in če lahko, kakšen je njihov mehanizem delovanja. Ali gre za neposreden vpliv z vezavo na monomerne, oligomerne infibrilarnivrst ali agregatov, ali je posreden z delovanjem na različne druge celične homeostatske mehanizme? Z našimi preiskavami smo identificirali dva človeška endogena presnovka, ki sprožita citoplazmatsko razvit proteinski odziv s povečanjem ravni HSF-1 in nižje J-proteinov spremljevalcev HSP40, kar končno povzroči očistek A agregati v aC. elegansmodel AD.

Rezultati

Identifikacija endogenih metabolitov kot regulatorjev homeostaze beljakovin z majhnimi molekulami. 

Da bi identificirali metabolite, povezane zAD, smo začeli z izračunom fragmentov in rezultatov podobnosti35 (glej"Metode" odsek) majhnih molekul, o katerih so Cala mini et al poročali kot regulatorji homeostaze beljakovin.34 (sl.2a). Z uporabo teh fragmentov smo pregledali bazo podatkov o človeškem metabolomu (HMDB)36 za metabolite, odkrite v cerebrospinalni tekočini (cerebrospinalni tekočini). Ker je cerebrospinalna tekočina v neposrednem stiku z zunajceličnim prostorom možganov, ponuja okno v presnovo možganov, tako da odraža biokemijo možganov.37 v obliki z njim povezanih metabolitov. V tem delu smo upoštevali le endogene presnovke, saj smo želeli preučiti molekule, ki so aktivne v primarnih celičnih mehanizmih, ne da bi vključevali eksogene presnovne produkte. Naše sklepanje je, da lahko osredotočanje na endogene metabolite pomaga identificirati temeljne celične procese, ki so ogroženi pri nevrodegeneraciji kot odziv na okolje in/ali celične žalitve. Ker sta odkrivanje in kvantifikacija metabolitov v telesnih tekočinah zahtevna, smo filtrirali le tiste metabolite, ki so bili obsežno odkriti in kvantificirani. Nato smo uporabili bazo podatkov KEGG38 za identifikacijo biokemičnih poti, povezanih s temi metaboliti, in nadalje metabolitov, ki so še posebej neregulirani pri nevrodegeneraciji (dodatni podatki 1). V primeru disregulacije so ravni regulacije navzgor in navzdol teh metabolitov na voljo v HMDB in povezani literaturi, ki je tam na voljo. Nato smo izvedli iskanje literature, da bi potrdili nereguliran status metabolitov pri nevrodegeneraciji. To stanje smo uvrstili kot rezultat povezave z iskanjem po PubMed (glejte"Metode" razdelek) (dodatni podatki 1). Načeloma asociacijski rezultat opisuje povezavo AD z identificiranim endogenim metabolitom v študijah, o katerih poroča PubMed. Razvrstitev identificiranih metabolitov na regulirane in znižane daje vpogled v učinke njihovih normalnih koncentracij na vzdrževanje celične homeostaze in njihovo disregulacijo pri bolezni. Ugotovili smo, da je 186 od 380 endogenih metabolitov CSF nereguliranih pri nevrodegeneraciji (dodatni podatki 1). Nato smo se osredotočili na šest od teh metabolitov: 1-metilhistidin, homovanilna kislina, melatonin,L-karnozin, vanilglikol in kinurenska kislina (tabela1), ki so bili izbrani, ker so delili prekrivajoče se fragmente z znanimi regulatorji homeostaze beljakovin HSF-1 (sl.2b). Nato smo eksperimentalno raziskali njihove možne vloge pri moduliranju agregacije A 42, zelo citotoksično 42-ostankovno obliko A .

Karnozin in kinurenska kislina rešujeta C. elegans model AD. C. elegansje dobro označen model staranja, ki ima temeljne biokemične podobnosti s človekom.

Poleg tega s povprečno življenjsko dobo 2–3 tedne je močno in vivo orodje za preučevanje agregacije beljakovin. Ker preiskujemo endogene metabolite in smo želeli raziskati, ali in s katerim mehanizmom lahko metaboliti očistijo agregate, smo razmislili o izbiriC. eleganssistem in vivo za presejanje namesto pristopa presejanja in vitro. Najprej smo izvedli presejanje, odvisno od odmerka (0, 1, 5 in 10μM) (razširjeni podatki na dodatnih slikah 1 in 2) šestih metabolitov, ki smo jih identificirali kot regulatorje proteostaze, da bi testirali splošno primernost dobro uveljavljenegaC. elegansmodel GMC101 (GMC), v katerem A 42 je prekomerno izražen v velikih mišičnih celicah39. Ta model prikazuje od starosti odvisno nastajanje vključkov in s tem povezano toksičnost, ki jo je mogoče izmeriti z zmanjšanjem števila upogibov telesa na minuto (BPM), povečanjem stopnje paralize in zmanjšanjem hitrosti gibanja39 (sl.3). Poročamo o kakršnih koli znakihfifine more vplivati ​​na zdravljenje z metabolitom kot spremembe v splošni telesni pripravljenosti, pri čemer upoštevamo telesno pripravljenost kot skupni vedenjski odziv črvov kot funkcijo BPM, hitrosti (mm/s) in živega razmerja. Uporabili smo Thioflflavin-T (ThT) kot pozitivna kontrola, za katero je bilo prej dokazano, da močno podaljša življenjsko dobo in upočasni staranje pri odraslihC. elegans40; ti koristni učinki THT so odvisni od HSF-1, odpornosti na stres in transkripcijskega faktorja dolgoživosti SKN-1, molekularnih spremljevalcev, avtofagije in proteasomskih funkcij40 (Dopolnilni sliki 1 in 2). GMC in črvi divjega tipa N2 so bili premaknjeni na metabolite na stopnji L4, da bi se izognili razvojnim učinkom, in podvrženi testom gibljivosti 5. dan odrasle dobe, ko so fenotipske manifestacije A 42 strupenost je izrazita (sl.3). Ugotovili smo, da so trije presnovki, karnozin, kateri koli glikol in kinurenska kislina, izboljšali sposobnost črvov v primerjavi z nezdravljenimi črvi GMC (dopolnilni sliki 1, 2 in za podrobno karakterizacijo glejte sl.3). Uporabili smo ThT kot pozitivno kontrolo za črvefifitness40. Ugotovili smo, da so bili rezultati, dobljeni s karnozinom in kinurensko kislino, zelo ponovljivi v smislu povečane gibljivosti in izrazito zmanjšanih agregatov, obarvanih z NIAD-4-, v primerjavi z neobdelanimi črvi, zato smo ta dva metabolita izbrali za nadaljnjo karakterizacijo.

Slika 2 Identifikacijaendogenih metabolitov kot regulatorjev homeostaze beljakovin, ki so pri AD neregulirani. aShema strategije, ki temelji na računalniških fragmentih, ki smo jo uporabili za identifikacijo endogenih metabolitov iz podatkovne baze človeških presnovkov (HMDB) kot kandidatov za regulatorje homeostaze beljakovin, ki so prav tako neregulirani pri AD.b S tem pristopom smo identificirališest možnih metabolitov, ki služijo kot regulatorji homeostaze beljakovin (tabela1, dopolnilna slika 1 in dopolnilni podatki 1).

Pri različnih odmerkih metabolitov tako karnozin kot kinurenska kislina kažeta jasen odziv pri izboljšanju motilitete 5. dan (slika 1).3b–e) v primerjavi z začetnimi (mlajšimi) dnevi odraslosti. Gibljivost GMC (v BPM) je bila največja pri koncentraciji 15μM karnozin in 10μM kinurenska kislina z ustreznim manjšim številom agregatov (sl.3f, g). Videli smo, da je karnozin enako učinkovit v koncentracijskem območju 10–25 μM, in. kinurenska kislina je bila najbolj učinkovita pri znižanju agregatnega števila pri 15μkoncentracija M.

V obeh primerih nadaljnje zvišanje koncentracij (Večje ali enako50 μM) niso pokazale nobenega izboljšanja gibljivosti, verjetno zaradi nepovezanih toksičnih učinkov metabolitov vC. elegans(Dodatna slika 1h, i). Nismo opazili očitnih učinkov karnozina in kinurenske kisline na spremembe gibljivosti črvov in skupnegafitnesrezultat pri črvih divjega tipa N2 (dodatna slika 4). Skupajfitnesrezultat se izračuna z uporabo meritev, ki vključujejo upogibe telesa, hitrost, stopnje paralize, površino na žival in povprečne napake. Posledičnoprstni odtisse ustvari v obliki radarske karte z uporabo odprtokodne programske opreme, kot je opisano v Perni et al.41.