Dva človeška presnovka rešujeta C. Elegansov model Alzheimerjeve bolezni prek citosolnega razvitega proteinskega odziva Ⅲ

Slika 6 RTqPCR kaže, da karnozin in kinurenska kislina aktivirata citosolni razvit proteinski odziv z zvišanjem ravni transkripta J proteinovdnj-12 indnj-19 v 5. dnevu GMC črvi.GMC črvi so bili dani 15μM karnozin in kinurensko kislino ter njihove ravni mRNA smo spremljali z RTqPCR.a Opazili nismo nobenih znakovfifine more spremeniti ravni mRNAhsf-1, hsp-90, inhsp-70. Znaki zdravljenja s karnozinomfifineznatno povišane ravni transkriptov J-proteinov razreda A in B, DNJ-12, DNJ-13 in DNJ-19. Kinurenska kislina pa je zvišala ravni samo J-proteinov razreda A, DNJ-12 in DNJ-19. Spremembe v ravneh transkripta J-proteinov so v korelaciji s spremembami ravni beljakovin in so podprte tudi z našimi poskusi zrušitve RNAi, kjer DNJ-13 ne kaže vloge pri čiščenju agregatov A 42 agregatov (sl.8a, b). b Testirali smo tudi morebitne spremembe v UPRER in UPRmt po dajanju karnozina in kinurenske kisline, vendar nismo našli znakovfifine more spremeniti markerjev,hsp-4inhsp-6, kar ustreza aktivaciji teh poti oz. Vsi podatki predstavljajo štiri biološke ponovitve 5. dnecistancheGMC. Os Y predstavlja stanje/GEOMEAN, kjer se stanje nanaša na vsakegahsf-1, daf-21, hsp-70, dnj-12, dnj-13, dnj-19, hsp-4,inhsp-6, GEOMEAN pa je geometrična sredina dveh gospodinjskih genovrpb-2incdc-42za normalizacijo. Izvedli smo statistiko z uporabo GraphPad Prism z uporabo enosmerne ANOVA s Tukeyjevo parno primerjavo stolpcev proti neobdelanim črvom GMC (AD) za vsako stanje, zdravljeno z metaboliti. Vse vrstice napak predstavljajo standardno napako povprečja (SEM). Pomembnostp-vrednosti so navedene nad črtnim grafikonom. ns pomeni statistično nepomembno.

Kliknite tukaj, če želite izvedeti več o Cistanche za zdravljenje Alzheimerjeve bolezni

povečane ravni molekularnih spremljevalcev, smo uporabili interferenco RNA (RNAi), da bi zrušili specifične gene, in vprašali, ali to razveljavi učinke karnozina ali kinurenske kisline na agregacijo in toksičnost A 42. Če HSF-1 igra vlogo pri očistku agregatov A 42, potem bi knockdown HSF-1 pokazal očiten fenotip, pozitiven na agregat, s povečano paralizo črvov. Dejansko je bilo tako, ko smo izvedli RNAi proti hsf-1 (glejte razdelek »Metode«) in zdravili GMC črve z vodo, karnozinom in kinurensko kislino (slika 7). V praznem vektorju L4440 vidimo, da tako karnozin kot kinurenska kislina očistita agregate A 42 in povečata splošno kondicijo v primerjavi s črvi RNAi, kjer je hsf-1 uničen pred zdravljenjem z obema presnovkoma (slika 7a) . Pri teh GMC hsf-1 knockdown črvih opazimo večje število agregatov A 42 (sl. 7b, c) skupaj z zmanjšanjem splošne telesne pripravljenosti (sl. 7a), tudi če so dopolnjeni z metaboliti. Tako na splošno vidimo, da so bili koristni učinki karnozina in kinurenske kisline izrazito zmanjšani po zrušitvi hsf-1 z uporabo RNAi (slika 7a). Upoštevajte, da divji tip črvov N2, tako zdravljenih kot nezdravljenih, ni pokazal očitnih razlik v celotni paralizi pri knockdownu hsf-1 (slika 7a radarski prikaz in stolpčni prikaz N2). Prejšnje študije so pokazale, da lahko celoten učinek RNAi traja več kot 48 ur, da se vzpostavi pomemben knockdown fenotip 52, 53, zato se 5. dan naši rezultati ujemajo. Kot nadaljnja študija bo zanimivo raziskati učinek teh metabolitov na časovni potek staranja pri zdravih črvih. Nato smo posamezno podrli gene daf-21 (HSP90), hsp-1 (HSP70), dnj-13, dnj-12, dnj-19 in hsp-110 z uporabo RNAi za preučevanje posledičnih učinkov nacistanchegibljivost po zdravljenju s kinurensko kislino. DNAJ (HSP40) sodeluje s HSP70 za spodbujanje ponovnega zvijanja in HSP110 za spodbujanje razčlenitve. s kinurensko kislino (slika 8a, b). Čeprav nismo opazili. Zato smo tudi menili, da ima HSP110 v naši študiji RNAi pomembne učinke v vsakem knockdown stanju (slika 8c) na 5. dan preverjanja splošnih vedenjskih učinkov in agregacije A 42 v C. v odrasli dobi po zdravljenju s kinurensko kislino. je bil elegan. Opazili smo povečane agregate A 42 pri vsakem udarcu - znatno povečanje splošne telesne pripravljenosti v skupini s praznim vektorjem L4440 navzdol po GMC skupini, ki je bila sicer zavrta z zdravljenjem po zdravljenju s kinurensko kislino v primerjavi z nezdravljenimi črvi GMC (AD). To kaže, da kinurenska kislina dejansko očisti agregate A 42, ki jih posredujejo ti spremljevalci, kar povzroči izboljšanje gibljivosti črvov, ki izražajo A 42-. Skupaj naši podatki iz Western blotov, RTqPCR in RNAi kažejo, da zdravljenje s kinurensko kislino in karnozinom zviša ravni HSF-1 vcistanchemodel AD, kar ima za posledico regulacijo transkripcije in s tem povečane ravni J-proteinov DNJ- 12 in DNJ-19. Zdi se, da to sodeluje in vsaj zahteva več osrednjih spremljevalcev, kot so HSP70, HSP90 in HSP110, za zaščito pred agregacijo A 42 in s tem povezano toksičnostjo vcistanche(slika 8c). Naši podatki skupaj kažejo, kako dva presnovka sprožita citosolni odziv beljakovin vcistanchemodel AD za čiščenje agregatov A 42 in njihove povezane toksičnosti. Ker so ravni teh metabolitov lahko povezane s starostjo ali boleznijo, predlagamo, da so metaboliti lahko induktorji zaščitnih celičnih odzivov za nadzor kakovosti, ki ščitijo predz boleznijo povezano združevanje beljakovin(slika 8c).

Slika 7 Karnozin in kinurenska kislina ščitita pred agregacijo A 42 in toksičnostjo na način, ki je odvisen od HSF-1-. aRNAi knockdown hsf- kaže zmanjšano gibljivost pri GMC (AD) črvih. L4440 je prazen vektorski nadzor. Pri zdravljenju s karnozinom in kinurensko kislino opazimo znatno povečanje motilitete v fenotipu L4440 v primerjavi z zmanjšanjem v skupinah hsf-1(RNAi). Kontrolni črvi N2 ne kažejo pomembnega učinka metabolitov karnozina (Car) in kinurenske kisline (Kyn). Radarska karta prikazuje splošnoprimerjavo s primerjavo treh kvantitativnih spremenljivk: hitrosti polža (mm/s), upogibov na minuto in razmerja žive moči, kot je razvidno na njegovi osi. Vstavljeni stolpčni graf kaže, da razbijanje hsf-1 z RNAi bistveno zmanjša koristne učinke karnozina in kinurenske kisline. Statistika je bila izvedena z uporabo enosmerne ANOVA, Dunnettovega testa večkratnih primerjav proti neobdelanemu praznemu vektorju A 42. ****str< 0.0001; ***p< 0.001; **p< 0.01; *p< 0.05 (b). A corresponding decrease in NIAD-4 aggregates is observed in AD worms treated with carnosine and kynurenic acid (Scale bars, 80μm). For NIAD-4 staining, approximately 11–30 animals were analyzed per condition. All error bars represent SEM. Statistics were performed using one-way ANOVA Dunnett's multiple comparisons test against the untreated Aβ42 empty vector.****p< 0.0001; ***p< 0.001; **p< 0.01; *p< 0.05.cRepresentative images of Aβ42 plaques show a signifificant clearance of aggregates in worms treated with carnosine (Car) and kynurenic acid (Kyn).hsf-1 knockdown worms even when treated with carnosine and kynurenic acid did not clear aggregates. White arrows point to NIAD-4-stained Aβ42 aggregates, which appear orange-red in color. For comparison, an empty RNAi vector L4440 GMC worm head is shown.

Slika 8 Kinurenska kislina preprečuje toksičnost A 42 pri acistanchemodel AD z delovanjem molekularnih spremljevalcev. Pri zdravljenju z 10 μM kinurenske kisline aktivira HSF-1 citosolni razvit proteinski odziv in vključuje HSP-90, HSP-70, HSP-110, HSP40 J proteine ​​DNJ{ {6}} in DNJ-19, vendar ne DNJ-13 (plošče a–c). Splošna kondicija (upogibi na minuto, hitrost in preživetje) v acistanchemodel AD (GMC črvi) je ogrožen tudi po zdravljenju z 10 μM kinurenske kisline v hsf-1, daf-21, hsp-70, hsp{{4} }, dnj-12, dnj-13 in dnj-19 padci v primerjavi s kontrolo L444{{30}} (c). Opaziti je ustrezno povečanje agregatov NIAD-4 (a in b). Vendar pa ne vidimo nobenih agregatov pri uničevanju dnj{{10}}, J-proteina razreda B, kar kaže, da morda ne igra vloge pri čiščenju agregatov A 42. Bele puščice kažejo na NIAD-4-obarvane agregate A 42, ki so videti oranžno-rdeče barve (lestvice, 80 μm). Za teste motilitete, n=~260–1000 živali na pogoj, za NIAD-4 test obarvanja n=11–29 za vse pogoje, razen knockdown hsp110, za katerega n=4 . Vse vrstice napak predstavljajo SEM. statistiki a in c sta bili izvedeni z uporabo enosmerne ANOVA, Dunnettovega testa večkratnih primerjav proti kontrolni skupini L4440 AD, zdravljeni z 10 μM kinurenske kisline, ****p < 0,0001; ***p < 0,001; **p < 0,01; *p < 0,05. d Shema mehanizma, s katerim metaboliti očistijo beljakovinske agregate s posredovanjem odziva na toplotni šok. Predlagamo, da je presnovna disregulacija tako lahko prvi dejavnik, ki prispeva k neravnovesju v homeostazi beljakovin.

neobdelani GMC (AD) črvi. To kaže, da kinurenska kislina dejansko očisti agregate A 42, ki jih posredujejo ti spremljevalci, kar povzroči izboljšanje gibljivosti črvov, ki izražajo A 42-. Skupaj naši podatki iz Western blotov, RTqPCR in RNAi kažejo, da zdravljenje s kinurensko kislino in karnozinom zviša ravni HSF-1 v cistanche modelu AD, kar ima za posledico regulacijo transkripcije in s tem povečane ravni DNJ{{ 3}} in DNJ-19 J-proteini. Nato se zdi, da to sodeluje z in vsaj zahteva več jedrnih spremljevalcev, kot so HSP70, HSP90 in HSP110, za zaščito pred agregacijo A 42 in s tem povezano toksičnostjo v cistanhi (slika 8c). Naši podatki skupaj kažejo, kako dva presnovka sprožita citosolni razgrnjeni proteinski odziv v cistanche modelu AD, da očistita agregate A 42 in njihovo povezano toksičnost. Ker so ravni teh metabolitov lahko povezane s starostjo ali boleznijo, predlagamo, da so metaboliti lahko induktorji zaščitnih celičnih odzivov za nadzor kakovosti, ki ščitijo pred z boleznijo povezano agregacijo beljakovin (slika 8c).

Diskusija

Pokazali smo, kako je mogoče mrežo homeostaze beljakovin, ki obsega več soodvisnih mehanizmov, vključno z molekularnimi spremljevalci, razstrupljevalnimi encimi in mehanizmi očistka beljakovin54, modulirati z endogenimi metaboliti. Poročali smo o knjižnici endogenih presnovkov, ki jih je mogoče nadalje raziskati glede delovanja na različne celične mehanizme, povezane s homeostazo beljakovin, in opisali smo dva presnovka, karnozin in kinurensko kislino, za njuno vlogo pri očistku beljakovinskih agregatov. Ta dva presnovka lahko zavirata agregacijo A 42 v cistančnem modelu AD tako, da sprožita citosolni odziv proteina, ki ga posreduje HSF-1, in povečane ravni DNJ-12 in DNJ-19 J -beljakovine. Predvidevamo, da bodo nadaljnje študije razkrile, kako ti metaboliti zvišujejo ravni HSF-1 in s tem uravnavajo njegovo delovanje.

Predlagamo model za obnovo proteinske homeostaze z endogenimi presnovki (slika 8c), kjer dva endogena presnovka uravnavata HSF-1 in spremljevalce navzdol, da očistijo agregate A 42. Kar zadeva čiščenje agregatov, je verjetno, da (1) se agregati množično odstranijo z avtofagijo, saj so Kumsta in sodelavci avtofagijo povezali z aktivnostjo HSF-1, ali (2) povečani nadzorniki spodbujajo promet proteina A 42, s čimer se prepreči nastajanje agregatov. Ne more biti, da spremljevalci samo blokirajo agregacijo, saj ne vidimo ustreznega povečanja ravni topnega A 42. Karnozin je dipeptid, ki se naravno pojavlja v možganih, ledvicah in skeletnih mišicah rib, ptic in sesalcev56. Postmitotične odrasle celice imajo višje koncentracije karnozina kot aktivno deleče celice, čeprav razlogi niso jasni57,58; Sinteza karnozina je povezana le s končnimi stopnjami zorenja glialnih celic. Prav tako je prisoten samo v postmitotskih nevronih mrežnice, ko energetski metabolizem preklopi iz glikolize v oksidativno fosforilacijo56. Zanimivo je, da so opazili tudi ugoden, vendar neopredeljen organizacijski učinek karnozina na mitohondrije; njegove ravni se spreminjajo glede na energijski metabolizem celice pri staranju56. Te študije skupaj kažejo, da karnozin blagodejno vpliva na celično aktivnost.

Vidimo, da je pri bolezni karnozin znižan (tabela 1), naše študije pa kažejo, da dodatki rešujejo fenotip bolezni AD. Njegov kasnejši metabolizem pri dodatkih je problem, poudarjen za prihodnje študije. Razjasnitev njegovega mehanizma delovanja v kontekstu čiščenja beljakovinskih agregatov je torej koristna pri izkoriščanju njegovega terapevtskega potenciala. Kinurenska kislina je metabolit triptofana, ki ima protivnetne in imunosupresivne funkcije 59, 60, poleg tega pa deluje kot antagonist, ki vpliva na vse ionotropne glutamatne receptorje, vključno z NMDA, AMPA in kainitnimi receptorji 61. Čeprav se domneva, da kinurenska kislina deluje nevroprotektivno pri veliki večini nevroloških stanj, njeni mehanizmi delovanja niso popolnoma razjasnjeni. Poročajo, da so ravni kinurenske kisline in povezanih metabolitov pri ljudeh z motnjami spanja62,63 in depresijo64 neregulirane, kar kaže tako regulacijo navzgor kot navzdol (tabela 1). Poročali so, da so vzorci spanja/budnosti moteni pri AD65. Čeprav je bila depresija povezana kot dejavnik tveganja za razvoj AD, študija povezav celotnega genoma ni pokazala pomembnega genetskega prekrivanja med obema boleznima66; zanimivo je, da bi lahko prekrivanje dejansko razložili z motnjo homeostaze nevrotransmiterjev67. Poleg tega so poročali, da vzdržljivostna vadba zvišuje plazemske ravni kinurenske kisline 68. Prej se je domnevalo, da je pot kinurenina regulator s starostjo povezane toksičnosti beljakovin69.

V modelu cistanche so van der Goot et al. kažejo, da zmanjšanje triptofan 2,3-dioksigenaze (v-2), prvega encima v kinureninski poti razgradnje triptofana, poveča ravni triptofana in zavira toksičnost proteinov, nagnjenih k agregaciji; poleg tega kažejo, da hranjenje z L-triptofanom tudi zavira toksičnost69. V tej študiji prikazujemo reševanje fenotipa bolezni AD z dodatkom kinurenske kisline; znano je, da pri cistah in sesalcih kinurenska kislina nastaja v prostorsko omejenih vzorcih v živčnem sistemu, zato menimo, da bo spreminjanje njenih ravni endogeno, na tkivno specifičen način, dodatno dalo vpogled v to, kako njene endogene ravni vplivajo na ciljne proteine . Naši rezultati o njegovem mehanizmu delovanja na čiščenje beljakovinskih agregatov osvetljujejo sistematično izkoriščanje njegovega terapevtskega potenciala. Naši rezultati skupaj poudarjajo potrebo po podrobnejšem raziskovanju učinka nenormalne presnovne homeostaze pri razvoju motenj napačnega zlaganja beljakovin. Zaključki Rezultati, o katerih smo poročali v tej študiji, podpirajo stališče, da sta homeostaza metabolitov in homeostaza beljakovin tesno povezani in bistveni za celotno celično homeostazo. Zlasti homeostaza metabolitov je lahko motena na način, povezan s starostjo, in je lahko povezana z boleznimi napačnega zlaganja beljakovin. Na splošno naši rezultati podpirajo stališče, da lahko ponovno uravnoteženje celične homeostaze z vzdrževanjem presnovne homeostaze ponudi preventivne pristope za nevrodegenerativne bolezni.

Metode

Identification of endogenous metabolites in the HMDB. We used 200 molecules as starting points, hereby referred to as seeds, from Calamini et al. 34 to calculate fragments using a method reported by Joshi et al. 35. We screened the HMDB using similarity and Tanimoto coefficients (>0.6) začetnih semen. Dobljeni zadetki so bili filtrirani, če so izpolnjevali naslednje pogoje: endogeni, kvantificirani in zaznani, zaznani v CSF. Nadalje smo izračunali, ali so bile regulirane navzgor ali navzdol na podlagi normalnih v primerjavi z nenormalnimi fiziološkimi koncentracijami, sporočenimi v HMDB. Ta korak smo izvedli z iskanjem literature, da bi ocenili njihovo povezavo z boleznijo, kjer smo presnovke razvrstili na podlagi asociacijskega rezultata, ki smo ga operativno opredelili kot število študij, v katerih je bil metabolit pri AD nereguliran. V ta namen smo iskali v PubMed "Alzheimerjeva bolezen IN metabolit", kjer se "metabolit" nanaša na vsak metabolit v dodatnih podatkih 1.

Ekspresija, čiščenje in priprava vzorcev peptida A 42 za kinetične poskuse.

Rekombinantni peptid A 42 (MDAEFRHDSGYEVHHQKLVF FAEDVGSNKGA IIGLMVGGVVIA) je bil izražen v sevu Escherichia coli BL21 Gold (DE3) (Stratagene, CA, ZDA) in očiščen, kot je opisano prej70. Na kratko, v postopku čiščenja so bile celice E. coli sonikirane, inkluzijska telesca pa nato raztopljena v 8 M sečnini. Dietil-aminoetil celulozno smolo smo nato uporabili za izvedbo ionsko izmenjevalne kromatografije in zbrane beljakovine liofilizirali. Te frakcije smo nato dodatno očistili s kolono Superdex 75 26/60 (GE healthcare, IL, ZDA) in frakcije, ki vsebujejo rekombinantni protein, smo združili, zamrznili in ponovno liofilizirali. Raztopine monomernega proteina so bile pripravljene z raztapljanjem liofiliziranega peptida A 42 v 6 M GuHCl in očiščene v 20 mM natrijevega fosfatnega pufra, 200 µM EDTA, pH 8,0 z uporabo Superdex {{15} }/300 kolona (GE Healthcare) s sorazmerno hitrostjo 0,5 ml/min. ThT smo dodali iz 2 mM zaloge, da smo dobili končno koncentracijo 20 µM. Vse vzorce beljakovin smo pridobili iz istega posameznega pripravka in nato pipetirali v Eppendorfove epruvete z nizko vezavo. Vsak vzorec je bil nato pipetiran v več vdolbinic 96-plošče s polovično površino vdolbinice, nizko vezavo, prozornim dnom in PEG prevleko (Corning 3881), 80 µl na vdolbino, v odsotnosti in prisotnosti različnih molarnih ekvivalentov karnozina ali kinurenske kisline, da dobimo končno koncentracijo 1 odstotka DMSO (v/v). Agregacija A 42 (pri koncentraciji 2 µM70,71,72 se je začela tako, da se je plošča z vdolbinicami postavila v čitalnik plošč (Fluostar Omega ali Fluostar Optima iz BMG Labtech, Aylesbury, UK) pri 37 stopinjah v mirovanju Fluorescenca ThT FL je bila spremljana v treh izvodih na vzorec, kot je bila izmerjena z uporabo spodnje optike s 440 nm vzbujevalnimi in 480 nm emisijskimi filtri. Kinetične sledi so bile nato pridobljene za vsako vdolbinico in nato obdelane v masni delež fibrilar z normalizacijo fluorescence ThT FL vrednosti v danem času t glede na začetno vrednost fluorescence ThT FL (ki je vzeta kot 0) in končno vrednost fluorescence ThT FL na koncu reakcije (ki je vzeta kot 1,0).

Cistancheeksperimenti Mediji. Za razmnoževanje cistanche73 so bili uporabljeni standardni pogoji. Na kratko, živali smo sinhronizirali z beljenjem s hipokloritom, jih čez noč izvalili v pufru M9 (3 g/l KH2PO4, 6 g/l Na2HPO4, 5 g/l NaCl, 1 µM MgSO4) in nato gojili pri 20 stopinjah na gojišču za rast ogorčic (NGM). ) (CaCl2 1 mM, MgSO4 1 mM, holesterol 5 µg/ml, 250 µM KH2PO4 pH 6, agar 17 g/l, NaCl 3 g/l, kazein 7,5 g/l) zasejane plošče s sevom E. coli OP50. Nasičene kulture OP50 smo gojili tako, da smo 50 ml gojišča LB (tripton 10 g/l, NaCl 10 g/l, kvasni ekstrakt 5 g/l) inokulirali z OP50 in kulturo inkubirali 16 ur pri 37 stopinjah. Plošče NGM smo zasejali z bakterijami tako, da smo v vsako ploščo dodali 350 µl nasičenega OP50 in plošče pustili pri 20 stopinjah 2–3 dni. Tretji dan po sinhronizaciji so bile živali postavljene na plošče NGM, ki so vsebovale 5-flfluoro-2'deoksi-uridin (FUDR) (75 µM), da bi zavirali rast potomcev, in temperaturo dvignili na 24 stopinj . sevi. Vsi sevi so bili pridobljeni iz genetskega centra Caenorhabditis v Minnesoti, ki ga podpira NIH P40 OD010440. Za te poskuse sta bila uporabljena dva seva. Temperaturno občutljiv človeški A-izražajoči sev dvIs100 [unc-54p::A-beta-1-42::unc-54 3′-UTR plus mtl-2p::GFP ] (GMC101), pri katerem mtl-2p::GFP povzroča ekspresijo GFP v črevesju, unc-54p::A-beta- 1-42 pa izraža človeški peptid A 42 polne dolžine v mišičnih celicah telesne stene. Zvišanje temperature nad 20 stopinj v fazi L4 ali odrasli povzroči paralizo zaradi agregacije A 42 v mišici telesne stene. Sev N2 je bil uporabljen za črve divjega tipa.

Plošče, prevlečene z metabolitom. Alikvote gojišča NGM smo avtoklavirali in prelili ter zasejali s 350 µl kulture OP50 in gojili čez noč. Po inkubaciji do 3 dni pri sobni temperaturi so dodali alikvote L-karnozina (karnozina) ali kinurenske kisline (ali drugih metabolitov), ​​raztopljenih v vodi v različnih koncentracijah. NGM plošče, ki so vsebovale FUDR (75 µM, razen če je navedeno drugače), so bile zasejane z 2,2 ml alikvoti spojine, raztopljene v vodi pri ustrezni koncentraciji. Plošče so bile nato postavljene v pokrov z laminarnim tokom pri sobni temperaturi, da se posušijo, in črvi so bili prenešeni na plošče, prevlečene z metabolitom na stopnji ličinke L4. Šest metabolitov je bilo prvotno pregledanih v tekočem mediju41. Karnozin smo pripravili pri sobni temperaturi do osnovne koncentracije 5 mM. Kinurensko kislino pripravimo pri 5 mM in raztapljanje spojine izvedemo pri 100 stopinjah. Zaloge spojine so bile do uporabe vzdrževane pri –20 stopinjah in nikoli odmrznjene več kot enkrat.

Automated motility assay. At different ages, animals were washed off the plates with M9 buffer and spread over an OP50 un-seeded 6 cm plate, after which their movements were recorded at 20 fps using a recently developed microscopic procedure for 60–90 s41,74. Approximately 100–600 animals were counted per condition at each indicated time point, unless otherwise specified for >600 (dodatni podatki 2). Avtomatizirana programska oprema za sledenje gibljivosti se izogne ​​podcenjevanju napak, ki so posledica trkov in prekrivanja črvov; zazna skupno število črvov in zagotavlja tudi zgornjo mejo napak z upoštevanjem največjega števila črvov, prisotnih v enem samem okvirju hkrati (dodatni podatki 2)41.

NIAD{0}} barvanje in slikanje. Raztopino NIAD-4 smo pripravili z raztapljanjem v 100 odstotnem DMSO pri 1 mg/ml. Pred inkubacijo črvov smo pripravili razredčino 1/1000 v M9. Po presejanju s platformo za sledenje ogorčic s širokim poljem je bilo približno 300 črvov na stanje zbranih v mediju M9 in centrifugiranih pri 20 stopinjah pri 2000 obratih na minuto 2 minuti v peleto. Peletu smo nato dodali 1 ml razredčene raztopine NIAD-4 v M9 in jo 6 ur rahlo stresali (80 vrt/min). Črve smo nato prenesli na NGM plošče brez zasejanj in jih inkubirali pri 20 stopinjah dvanajst ur. Črve smo ponovno sprali s plošč z medijem M9, zavrteli, sprali z 10 ml M9 in resuspendirali v 2 ml M9. Po gravitacijski sedimentaciji smo na 4-odstotne agarozne blazinice nanesli 15 µl raztopine črvov. Za anestezijo živali smo dodali 4 µl 40 mM NaN3, čemur je sledil steklen pokrov. Črvi so bili posneti z Zeiss Axio Observerjem

Fluorescenčni mikroskop A1 FL (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Nemčija) z objektivom × 20 in filtrom 49004 ET-CY3/TRITC (Chroma Technology Corp, VT, ZDA). Uporabljen je bil čas osvetlitve 1000 ms. Nominalna povečava je bila × 40, slike pa so bile posnete s kamero Evolve 512 Delta EMCCD z visoko kvantno učinkovitostjo (Photometrics, Tucson, AZ, ZDA). Približno 11–30 živali je bilo analiziranih na stanje, razen če je določeno drugače, statistika pa je bila izvedena z uporabo enosmerne ANOVA proti nezdravljeni skupini.

Vse statistike tukaj so bile izvedene z uporabo GraphPad Prism. Kvantifikacija je bila izvedena z uporabo ImageJ (NIH, MD, ZDA), da se določi povprečna intenzivnost sivine v glavi vsake živali. Filter »požar« je bil uporabljen v ImageJ za vizualizacijo agregatov,-4-obarvanih z NIAD. Celotno intenzivnost (povprečna siva vrednost) glave črva smo izračunali tako, da smo začrtali območje glave črva od nosu do žrela. Na 5. dan je največji premer črvov čez glavo 80 µm. Nato je bilo izračunano povprečje (po treh odčitkih) ozadje istega območja drugje na sliki in odšteto od skupne srednje sive vrednosti glave črva. Nastala intenzivnost po odštevanju ozadja daje odčitek agregatov, obarvanih z NIAD-4, ki so videti oranžno-rdeči in so označeni s puščicami na ustreznih slikah. Western blots. Približno 3000 črvov na stanje je bilo liziranih v PBS.

Lizatu smo dodali koktajl zaviralcev proteaz (Sigma MS-SAFE Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail). Anti-tubulin (monoklonsko protitelo proti alfa tubulinu, proizvedeno pri miših, Sigma, T6074) je bil uporabljen za odkrivanje konstitutivno izraženega tubulina za normalizacijo koncentracij beljakovin. Protitelesa HSF1 so bila pridobljena od Veene Prahlad (Iowa), HSP90 (zajčji anti-DAF-21) od Patricie Van Oosten-Hawle (Leeds), HSP40 (anti-DNJ-12, DNJ-13 , in DNJ-19, vsi vzrejeni v kuncih) Janine Kirstein (Berlin), HSP70 John Labbadia (UCL, London).

Uporabljena so bila mišja in zajčja sekundarna protitelesa (488-konjugirana sekundarna protitelesa Alexa Fluor). Vse kvantifikacije so bile izvedene s programsko opremo ImageJ za določitev intenzivnosti proteinskega traku z uporabo denzitometrije.3-4 Tehnične ponovitve so bile uporabljene za posamezno stanje, statistika pa je bila izvedena z uporabo dvosmerne ANOVA proti netretiranemu divjemu tipu (N2) in tretiranemu A 42 ( GMC) črvi, skupine. Vse statistike so bile izvedene z uporabo GraphPad Prism.

RNA interferenca. Bakterije, ki vsebujejo prazen vektor (L4440) ali vektor, ki vsebuje hsf-1 dsRNA, so gojili pri 37 stopinjah čez noč v LB, ki vsebuje 100 ug/ml ampicilina. Po rasti čez noč so bile kulture inducirane s 5 mM IPTG in rasle nadaljnje 3 ure pri 37 stopinjah. Kulture RNAi smo pustili, da so se ohladile na sobno temperaturo in jih nato posejali na plošče NGM, ki so vsebovale 100 ug/ml ampicilina in 1 mM IPTG. Bakterijske trate smo nato pustili, da se sušijo 4 dni na klopi. Kontrolni, hsf-1 in kloni RNAi spremljevalca v smeri toka so bili pridobljeni iz knjižnice Ahringer RNAi in so bili pred uporabo validirani zaporedje. Poleg tega je bilo v prejšnjih publikacijah dokazano, da ti kloni zrušijo predvidene tarče 48,75,76.

Ekstrakcije RNA, sinteza cDNA in RTqPCR. Približno 700, 5. dan, smo odrasle črve resuspendirali v 250 ul Trizola in homogenizirali z vrtinčenjem trikrat neprekinjeno 10 minuto z 20-minutnim počitkom obdobja na ledu med vsakim krogom vrtinčenja. Dodali smo kloroform (1/5 volumna), preden smo vzorce ročno stresali 15 s in nato 15 minut centrifugirali pri 13,000×g. Vodno fazo smo zbrali in zmešali z enakim volumnom 70 % etanola. RNA smo nato očistili s kompletom RNeasy po navodilih proizvajalca. cDNA smo nato sintetizirali iz 1 µg celotne RNA z uporabo reagentov za sintezo cDNA iScript (BioRad). RTqPCR je bil izveden z uporabo mešanice BioRad Advanced SYBR green master in termociklerja BioRad CFX96 z uporabo primerjev, opisanih v tabeli 2. Metoda standardne krivulje je bila uporabljena za kvantificiranje genske ekspresije, relativna ekspresija zanimivih genov pa je bila normalizirana na gospodinjske gene rpb{{15} } in cdc-42. Statistika in ponovljivost. Podatki, predstavljeni kot povprečje ± SEM, so bili testirani glede pomembnosti v enosmerni ANOVA z uporabo GraphPad Prism. Post-hoc primerjave so bile izvedene z Dunnettovimi večkratnimi primerjavami (slike 3, 5, 7 in 8) in Tukeyjevo parno primerjavo (slika 6). Za kinetične profile agregacije na sliki 4 so stolpci napak predstavljeni iz treh tehničnih ponovitev. Velikost vzorca: (a) testi gibljivosti n=100–600 črvov, razen če je določeno drugače (b) western bloti n=~3000 črvov za vsako poskusno ponovitev, (c) združevanje NIAD-4 test n=11–30 živali na pogoj za GMC in n=~10–12 živali na kontrolo (N2) in (d) qPCR n=4 bioloških ponovitev. Vsi pregledi, vključno z RNAi, so bili izvedeni pod sledilnikom gibljivosti črvov, ki je zaslepil skupinsko identiteto in nato primerjal. Statistični rezultati so bili označeni glede na kritične p-vrednosti: ****p < 0,0001; ***p < 0,001; **p < 0,01; *p < 0,05.

Reference

1. De Strooper, B. & Karran, E. Celična fazaAlzheimerjeva bolezen. Celica 164, 603–615 (2016).

2. Knowles, TP, Vendruscolo, M. & Dobson, CM Amiloidno stanje in njegova povezava z boleznimi napačnega zvijanja beljakovin. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 384–396 (2014).

3. Selkoe, DJ & Hardy, J. Amiloidna hipotezaAlzheimerjeva bolezenpri 25 letih. EMBO Mol. med. 8, 595–608 (2016).

4. Hipp, MS, Park, SH & Hartl, FU Okvara proteostaze pri boleznih napačnega zlaganja in agregacije beljakovin. Trends Cell Biol. 24, 506–514 (2014).

5. Morimoto, RI & Cuervo, AM Proteostaza in proteom staranja v zdravju in bolezni. J. Gerontol. A 69 (dodatek 1), S33–S38 (2014).

6. Gomes, AP & Blenis, J. Neksus za celično homeostazo: medsebojno delovanje med presnovnimi in signalnimi transdukcijskimi potmi. Curr. Opin. Biotehnologija. 34, 110–117 (2015). 7. Wilson, DF Regulacija celičnega metabolizma: programiranje in vzdrževanje presnovne homeostaze. J. Appl. Physiol. (1985) 115, 1583–1588 (2013).

8. Fontana, L. & Partridge, L. Spodbujanje zdravja in dolgoživosti s prehrano: od modelnih organizmov do ljudi. Celica 161, 106–118 (2015).

9. Longo, VD & Mattson, MP Postenje: molekularni mehanizmi in klinične aplikacije. Cell Metab. 19, 181–192 (2014).

10. Sinclair, DA K enotni teoriji omejevanja kalorij in regulacije dolgoživosti. Meh. Staranje Dev. 126, 987–1002 (2005).

11. Burkewitz, K., Zhang, Y. & Mair, WB AMPK na povezavi med energetiko in staranjem. Cell Metab. 20, 10–25 (2014).

12. Johnson, SC, Rabinovitch, PS & Kaeberlein, M. mTOR je ključni modulator staranja in s starostjo povezanih bolezni. Narava 493, 338–345 (2013).

13. Salminen, A. & Kaarniranta, K. AMP-aktivirana proteinska kinaza (AMPK) nadzoruje proces staranja prek integriranega signalnega omrežja. Staranje Res. Rev. 11, 230–241 (2012).

14. Zoncu, R., Efeyan, A. & Sabatini, DM mTOR: od integracije signala rasti do raka, diabetesa in staranja. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 21–35 (2011).

15. Burte, F. et al. Motena mitohondrijska dinamika in nevrodegenerativne motnje. Nat. Rev. Neurol. 11, 11–24 (2015).

16. Bush, AI Metalobiologija Alzheimerjeve bolezni. Trendi Neurosci. 26, 207–214 (2003).

17. D'Amelio, M. & Rossini, PM Razdražljivost možganov in povezljivost nevronskih sklopov pri Alzheimerjevi bolezni: od živalskih modelov do človeških ugotovitev. Prog. Neurobiol. 99, 42–60 (2012).

18. Freer, R. et al. Podpis beljakovinske homeostaze v zdravih možganih povzema ranljivost tkiva za Alzheimerjevo bolezen. Sci. Adv. 2, 1600947 (2016).

19. Ishii, M. & Iadecola, C. Presnovne in nekognitivne manifestacije Alzheimerjeve bolezni: hipotalamus kot krivec in tarča patologije. Cell Metab. 22, 761–776 (2015).

20. Knobloch, M. & Jessberger, S. Presnova in nevrogeneza. Curr. Opin. Neurobiol. 42, 45–52 (2017).

21. Labbadia, J. & Morimoto, RI Biologija proteostaze pri staranju in boleznih. Annu. Rev. Biochem. 84, 435–464 (2015).

22. Lovell, MA & Markesbery, WR Oksidativna poškodba DNK pri blagih kognitivnih okvarah in pozni fazi Alzheimerjeve bolezni. Nucleic Acids Res. 35, 7497–7504 (2007).

23. Menzies, FM, Fleming, A. & Rubinsztein, DC Ogrožena avtofagija in nevrodegenerativne bolezni. Nat. Rev. Neurosci. 16, 345–357 (2015).

24. Palop, JJ & Mucke, L. Amiloid-beta-inducirana nevronska disfunkcija pri Alzheimerjevi bolezni: od sinaps do nevronskih mrež. Nat. Neurosci. 13, 812–818 (2010).

25. Weissman, L. et al. Popravilo okvarjene baze DNK z izrezom v možganih posameznikov z Alzheimerjevo boleznijo in amnestično blago kognitivno okvaro. Nucleic Acids Res. 35, 5545–5555 (2007).

26. Winner, B. & Winkler, J. Odrasla nevrogeneza pri nevrodegenerativnih boleznih. Cold Spring Harb. Perspektiva. Biol. 7, a021287 (2015).

27. Wyss-Coray, T. Vnetje pri Alzheimerjevi bolezni: gonilna sila, opazovalec ali koristen odziv? Nat. med. 12, 1005–1015 (2006).

28. Yao, J. et al. Mitohondrijski bioenergetski primanjkljaj je pred Alzheimerjevo patologijo pri ženskih mišjih modelih Alzheimerjeve bolezni. Proc. Natl Acad. Sci. ZDA 106, 14670–14675 (2009).

29. Chiti, F. & Dobson, CM Napačno zvijanje beljakovin, tvorba amiloida in človeška bolezen: povzetek napredka v zadnjem desetletju. Annu. Rev. Biochem. 86, 27–68 (2017).

30. Benilova, I., Karran, E. & De, B. Strooper, strupeni oligomer Abeta in Alzheimerjeva bolezen: cesar, ki potrebuje oblačila. Nat. Neurosci. 15, 349–357(2012).

31. Gidalevitz, T., Prahlad, V. & Morimoto, RI Stres napačnega zlaganja beljakovin: od enojnih celic do večceličnih organizmov. Cold Spring Harb. Perspektiva. Biol.3, a009704 (2011).

32. Walter, P. & Ron, D. Razvit proteinski odziv: od stresne poti do homeostatske regulacije. Znanost 334, 1081–1086 (2011).

Vprašajte za več:E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plus 86 15292862950