Dva človeška presnovka rešujeta C. Elegansov model Alzheimerjeve bolezni prek citosolnega razvitega proteinskega odziva Ⅱ

Slika 3 Karnozin in kinurenska kislina preprečujeta A 42 toksičnost v acistanche model AD (GMC).Strategija presejanja in vivo za identifikacijo endogenih metabolitov, ki zavirajo A 42 združevanje je prikazano v (a). Pregledali smo šest identificiranih presnovkov kandidatov v acistanche model odAlzheimerjeva bolezen's bolezen. Metaboliti (prikazani kot M) so bili hranjeni na stopnji L4 črvov GMC in njihovi učinki so bili ocenjeni na 5. dan odrasle dobe z (i) gibljivostjotest, ki določa skupnofitnesčrvov v smislu sprememb v gibljivosti, kvantificiranih kot telesni upogibi na minuto (BPM) in (ii) kvantifikacije NIAD-4-obarvanega A 42 agregatov (podatki presejanja prikazani na dodatni sliki 1). Ploščeb–g pokazati karakterizacijo kinurenske kisline in karnozina za reševanje acistanche model AD. Plošče (b inc) prikazujejo gibljivost črvov, merjeno v upogibih telesa na minuto (BPM).Y-os proti dnevom odraslosti naX-os, zdravljena z naraščajočimi koncentracijami karnozina (modra) in kinurenske kisline (rdeča) v primerjavi z neobdelanimi črvi (črna). V življenjski dobi črva do 15 let so opazili povečano pogostost udarcevµM karnozina in kinurenske kisline (b inc). Gibljivost na 5. dan odraslosti, kjer so fenotipske manifestacije A 42 je vidnih v črvu GMC, kar pomenififini mogoče izboljšati s povečanjem karnozina na 15µM in za kinurensko kislino pri 10µM (d ine). Radarska karta prikazuje celotnofitnesodcistanche kot funkcija hitrosti, ovinkov na minuto (BPM) in živega razmerja, kot je razvidno na vsaki od njegovih osi (d ine). Agregatno barvanje je bilo kvantificirano po inkubaciji črvov z amiloidogeno specifičnim barvilom NIAD-4 (f–g) (lestvica, 80μm). Bele puščice v podoknih (f–g) kažejo na NIAD{0}}obarvan A 42 agregatov, ki so videti oranžno rdeče barve. Pri vseh testiranih koncentracijah je zdravljenje s karnozinom signififimočno zaviral A 42 združevanje v primerjavi s črvi GMC, kot je prikazano v (f). N2 nadzoruje črve, ki ne izražajo A 42, so prikazani za primerjavo (lestvica, 80μm). Podobno kot pri karnozinu, agregacija A 42 je zaviralo zdravljenje s kinurensko kislino, kot je prikazano v (g). Za pregledovanje agregatov NIAD-4 približno 15–23 živali je bilo analiziranih glede na stanje GMC (AD) črvov in∼10 živali na kontrolo (N2) črvov. Ugodne učinke kinurenske kisline in karnozina so opazili prin = 3 biološko neodvisni poskusi. Vse vrstice napak predstavljajo standardno napako povprečja (SEM). Statistika je bila izvedena z uporabo enosmerne ANOVA, Dunnett'večkratne primerjave z nezdravljenim A 42 skupino z uporabo GraphPad Prism,p-vrednosti so navedene na parcelah.

Slika 4 Karnozin in kinurenska kislina nimata neposrednih učinkov na A 42 združevanje.Kinetični profili agregacije 2μM A 42 vzorec vodsotnost (črna) in prisotnost naraščajočih koncentracij karnozina ali kinurenske kisline (predstavljene v različnih barvah). Postopek združevanjaA 42 ni znakfifirahlo pospešeno ali upočasnjeno zaradi prisotnosti enega od presnovkov (višje koncentracije presnovkov 20, 50, 100 in 500μM so prikazani na dodatni sliki 3). Vrstice napak so izražene kot standardni odkloni treh tehničnih ponovitev.

Kliknite tukaj, če želite izvedeti več o tem, kako Cistanche zdravi AD

Karnozin in kinurenska kislina ne zavirata neposredno agregacije A 42. Da bi preizkusili, ali lahko karnozin ali kinurenska kislina neposredno zavirata A 42 združevanja smo izvedli THTflfltest kemijske kinetike vezave uorescence (glejte"Metode" razdelek). Nismo pa opazili nobenih neposrednih učinkov teh dveh metabolitov na agregacijo A 42, vsaj v razmeroma širokem razponu koncentracij, ki smo jih testirali (sl.4 in dopolnilna slika 3), ki vključuje fiziološko pomembne, kar kaže, da mora biti prisoten drug mehanizem, ki deluje za čiščenje agregatov. Ker prisotnost tega mehanizma ne izključuje možnosti, da imajo drugi endogeni metaboliti neposreden učinek na A 42 združevanje, po možnosti potvorijo same agregate ali spodbujajo fazno ločevanje A 42 v citoplazmi, predlagamo, da bo zelozanimivo testirati druge endogene metabolite za tako neposreden učinek na agregacijo beljakovin.

Učinek zdravila Cistanche

Karnozin in kinurenska kislina povečata raven HSF-1 in molekularnih spremljevalcev. Nato smo raziskali učinke karnozina in kinurenske kisline na izražanje HSF-1, glavnega regulatorja HSR vcistanche. HSF-1 uravnava gene beljakovin toplotnega šoka, ki delujejo kot molekularni spremljevalci za vzdrževanje normalne konformacije beljakovin pod celičnim stresom, ponovno zvijajo napačno zvite beljakovine in usmerjajo nepopravljivo poškodovane beljakovine za razgradnjo42–44 (sl.5 in dopolnilna slika 5). Za identifikacijo smo uporabili validirano protitelocistanche HSF-1 z imunoprecipitacijo in masno spektrometrijo45, za sondiranje HSF-1 v lizatih črvov, zdravljenih s karnozinom ali kinurensko kislino. Po zdravljenju z obema presnovkoma smo opazili povečane ravni HSF-1 (sl.5a). Ravni HSF-1 so se povečale v odvisnosti od odmerka kot odziv na zdravljenje s karnozinom in kinurensko kislino (sl.5a). Vcistanche lizata, obdelanega z obema presnovkoma, smo opazili pas HSF-1 pri∼100 kDa. HSF-1 uravnava predvsem izražanje genov, ki kodirajo molekularne spremljevalce, zlasti proteine ​​toplotnega šoka HSP90, HSP70 in HSP40, ki delujejo kot kohaperon za HSP7046–48. Pregledali smo ravni jedrnih spremljevalcev, -1-reguliranih s HSF, in ugotovili, da so bile ravni HSP90 in HSP70 povišane pri črvih GMC, zdravljenih s 15μM kinurenska kislina, vendar ne 15μM karnozin v primerjavi z nezdravljenim GMC in črvi divjega tipa (sl.5b, c). Tako DNJ-12 kot DNJ-19 sta pokazala povišane ravni kot odziv na zdravljenje s karnozinom in kinurensko kislino v primerjavi z nezdravljenimi črvi GMC in zdravljenimi črvi divjega tipa N2 (slika 1).5d, e). V nasprotju s tem nismo opazili znakovfifine more spremeniti ravni DNJ-13 po zdravljenju z metabolitom (sl.5f). DNJ-12 in DNJ-19 sta kohaperona J-proteina razreda A (HSP40), ki sta bili in vivo in in vitro označeni zaradi svojih funkcij razgradnje beljakovin, ki spodbujajo zdravje organizma48. Za proteine ​​J je bilo predhodno tudi značilno, da imajo deagregazno aktivnost v acistanche model polyQ, kjer kompleksirani J-proteinski spremljevalci razreda A (DNJ-12 in DNJ-19) in B (DNJ-13) omogočajo deagregacijsko aktivnost prek povezav s HSP{{5} } in HSP-70, tako posamično kot v sinergijskem sodelovanju48,49. Naši podatki kažejo, da je povečanje ravni HSF-1 po zdravljenju s karnozinom in

kinurenska kislina spodbuja zvišanje ravni molekularnih šaperonov in kohaperonov, zlasti DNJ-12 in DNJ-19 za čiščenje A 42 agregatov. Nato smo vprašali, ali so bile spremembe ravni beljakovin posledica spremenjene transkripcije z izvajanjem kvantitativne PCR v realnem času (RTqPCR). Brez znakovfifiCant fold spremembe ravni mRNAhsf- 1, daf-21,inhspPo zdravljenju s katerim koli presnovkom so opazili -70. Vendar smo v skladu z našimi podatki o beljakovinah opazili, da so ravni mRNAdnj-12 indnj-19 so bile zvišane z zdravljenjem z obema presnovkoma. Zanimivo je, da so ravni mRNA zadnj-13 so bile povišane tudi pri črvih, zdravljenih s karnozinom, ne pa tudi s kinurensko kislino, kljub dejstvu, da noben znakfifiNa ravni beljakovin so opazili spremembe nadvišanja (sl.6a). Nadalje smo vprašali, ali so ti metaboliti sprožili UPR, povezan z ER (UPRUrgenca) ali mitohondrije (UPRmt) s sondiranjem ravni mRNAhsp-4inhsp-6, kanonične oznake UPRUrgencain UPRmt, oz50,51. Nobenih znakov ni bilofifiteh dveh markerjev v primerjavi s kontrolami ni mogoče spremeniti (sl.6b), s čimer so ti odzivi izključeni kot osnovni mehanizmi za očistek agregatov v tej študiji. Da bi ugotovili, ali zdravljenje s karnozinom in kinurensko kislino zavira A 42 strupenost in agregacija prek HSF-1 in

Slika 5 Karnozin in kinurenska kislina aktivirata citosolni odziv proteina prek HSF-1-odvisnega mehanizma.Western bloti kažejo različno povečanje ravni beljakovin pri zdravljenju z obema presnovkoma (a–f). Pri zdravljenju s karnozinom in kinurensko kislino opažamo relativno povečanje ravni beljakovin molekularnih spremljevalcev in njihovih ko-haperonov v lizatih črvov v primerjavi s kontrolami, neobdelanim N2 in GMC.n = ∼3000 črvov na stanje; izmerili smo 3–4 ponovitve na stanje; za vsako stanje je prikazan samo reprezentativni western blot. Iz poskusov, opisanih na sl.3, znakfifipri odmerku 15 so opazili nezmožnost povečanja gibljivosti in ustrezno zmanjšanje NIAD{0}}obarvanih agregatovμM obeh metabolitov. Vse vrstice napak prikazujejo standardno napako povprečja (SEM).a–f pokažite pasove HSF-1, molekularnih spremljevalcev in J proteinov, in sicer HSP-90, HSP-70, DNJ-12, DNJ-19 in DNJ{{ 5}} za črve N2 (divji tip) in GMC (model AD). Za vsak eksperiment Western blot smo uporabili signal Tubulina za normalizacijo celotne koncentracije beljakovin v vsakem pasu. Nato smo normalizirali vsak pogoj pasu spremljevalca/košaperona z ustreznim pasom tubulina iz istega poskusa, ki je potekal na vzporednem gelu, da smo narisali intenzivnosti v ImageJ. Gele za vsak pogoj smo izvajali hkrati, z uporabo istega tekočega pufra, v isti elektroforetski celici in istem sendviču za prenos Western blot na membrane. Te membrane so bile nadalje razvite z uporabo ustreznih protiteles (glejte"Metode" odsek, dodatna slika 5). Statistika se izvaja v GraphPad Prism z uporabo navadne enosmerne ANOVA; uporabili smo Dunnetta's večkratni primerjalni test z neobdelano (H2O) za vsako skupino, zdravljeno z metabolitom N2 in GMC;p-vrednosti so navedene vslikapodplošče.

E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plus 86 15292862950