Ultrazvočno podprta ekstrakcija fenolnih kislin, flavonolov in flavan-3-olov iz grozdnih lupin in pečk Muscadine z uporabo naravnih globokih evtektičnih topil in napovednega modeliranja z umetnim nevronskim mreženjem

Prosim kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza več informacij

PovzetekCilj te študije je bil raziskati učinkovitost ekstrakcije 9 naravnih globoko evtektičnih topil (NDES) s pomočjo ultrazvoka zafenolne kisline, flavonoli, in flavan{0}}oli v lupinah in semenih vinske trte (Carlos) v primerjavi s 75-odstotnim etanolom. Umetno nevronsko mreženje (ANN) je bilo uporabljeno za optimizacijo vsebnosti vode NDES, časa ultrazvočne obdelave, razmerja trdne snovi in ​​topila ter temperature ekstrakcije, da se doseže najvišji izkoristek ekstrakcije za elaginsko kislino, katehin in epikatehin. Na novo formuliran NDES (št. 1) je sestavljen iz holin klorida:levulinska kislina: etilen glikol 1:1:2 in 20 odstotkov vode sta ekstrahirala največjo količino elaginske kisline v koži, in sicer 22,1 mg/g. Ta dobitek je bil 173-kratnik tega za 75 odstotkov etanola. Modificiran NDES (št. 3), sestavljen iz holin klorida: prolina: jabolčne kisline 1:1:1 in 30 odstotkov vode, je izločil največjo količino katehina (0.61 mg/g) in epikatehina (0,89 mg/g) v lupini in 2,77 mg/g oziroma 0,37 mg/g v semenu. Optimalni izkoristek elaginske kisline v koži z uporabo NDES #1 je bil 25,3 mg/g (opazovano) in 25,3 mg/g (predvideno). Optimalni donos (katehin plus epikatehin) v semenu z uporabo NDES #3 je bil 9,8 mg/g (opazovano) in 9,6 mg/g (napovedano). Ta študija je pokazala visoko učinkovitost ekstrakcije izbranih NDES za polifenole v optimiziranih pogojih.

Za več informacij kliknite tukaj

Uvod

Naravna globoka evtektična topila (NDES) se pripravijo z mešanjem donorjev vodikove vezi z akceptorji vodikove vezi v ustreznem molskem razmerju [1]. Tališče ene komponente mora biti nižje od tališča druge [1]. Po segrevanju in mešanju ta medij pri sobni temperaturi postane tekočina. Voda se doda za stabilizacijo in polarizacijo zmesi. Raziskave na področju fitokemične ekstrakcije z uporabo NDES so se razširile zaradi njihove učinkovite ekstrakcijske sposobnosti in topnosti. Kljub temu ima več dejavnikov pomembno vlogo pri primerjavi NDES z organskimi topili, vključno z donosom, stroški, predelavo in toksičnostjo. Prejšnje raziskave so raziskovale NDES o ekstrakciji različnih polifenolov iz različnih živilskih matric. Na primer, Bubalo idr. (2016) so primerjali 5 NDES, vodo, 70-odstotni metanol (v/v) in nakisan 70-odstotni metanol (v/v), da bi ekstrahirali antociane, katehin in kvercetin-3-O-glukozid iz lupin rdečega grozdja. Ugotovljeno je bilo, da je NDES, sestavljen iz holin klorida: oksalne kisline (1:1) s 25 odstotki vode (v/v), najučinkovitejše ekstrakcijsko topilo [2]. V drugi študiji, Pani´c et al. (2019) so testirali 8 NDES in nakisali 70 odstotkov etanola ter opazili holin klorid: citronsko kislino (2:1) s 30 odstotki vode (v/v) kot najboljši NDES za ekstrakcijo antocianinov iz grozdnih tropin [3]. Muškatno grozdje (Vitis rotundifolia) izvira iz jugovzhodnih držav in je prvo gojeno divje grozdje v ZDA [4]. Grozdje Muscadine se prideluje v 12 državah in obsega približno 5000 hektarjev [5]. Obstaja 100 sort muskadinskega grozdja in vsaka se razlikuje po fizikalnih, senzoričnih ali kemičnih lastnostih [4]. Med njimi je Carlos zaradi visokega pridelka in doslednosti rasti široko razširjeno muskadno grozdje [4]. Grozdje Carlos muscadine je srednje veliko, bronaste barve, debelejše v kožici in vsebuje povprečno štiri semena [6]. Muscadine grozdje vsebuje znatne količinepolifenoliza katere je znano, da zmanjšajo vnetje [7], zavirajo rast tumorja prostate [8] in izboljšajo presnovne odzive diabetikov [9]. Grozdne tropine muskadine, stranski proizvod sočenja grozdja muskadine ali pridelave vina, so sestavljene iz lupin in semen. Prejšnja raziskovalna študija je uporabila mešanico aceton:voda:ocetna kislina (70:29,7:0,3, v/v) za ekstrakcijo fenolnih spojin iz semen, lupine in pulpe osmih kultivarjev muskadinskega grozdja, gojenega na Floridi, vključno s Carlosom [10]. Vendar sta uporaba vnetljivih organskih topil in njihova nizka ekstrakcijska učinkovitost ovirali praktično uporabo. Večino muškatnih tropin še vedno zavržemo kot odpadek. Umetno nevronsko mreženje (ANN) je sistem nelinearnega preslikave, ki ga sestavljajo različne osnovne procesne enote, povezane s ponderiranimi povezavami. Te procesne enote se imenujejo "nevroni" [11]. Umetno nevronsko mreženje je pristop strojnega učenja za predvidevanje ali napoved odziva na podlagi več vhodov [11]. Predhodne raziskave so uporabile metode odzivnih površin (RSM) za optimizacijo in napovedovanje ekstrakcije. Vendar pa je malo študij uporabilo ANN za isti namen. Na primer, Sinha et al. (2013) je predlagal, da ima ANN boljšo napovedno učinkovitost kot RSM pri ekstrakciji naravnega barvila iz semen Bixa Orellana (Annatto) [12]. V podobni študiji sta Ciric et al. (2020) so poročali, da je bil model ANN boljši od RSM za napovedovanje ekstrakcij fenolnih spojin iz česna [13]. Cilj te raziskave je bil raziskati učinkovitost ekstrakcije 9 NDES za fenolne kisline, flavonole in flavan-3-ole v primerjavi s 75-odstotnim etanolom s pomočjo ultrazvoka. ANN je bil uporabljen za napovedovanje in optimizacijo pogojev ekstrakcije na izkoristek fenolov. Hipoteza je bila, da NDES s posebnimi sestavami ekstrahirajo večje količine fenolnih kislin, flavonolov in flavan-3-olov kot 75-odstotni etanol, največjo učinkovitost ekstrakcije pa je mogoče doseči s prediktivnim modeliranjem na podlagi ANN.

2. Materiali in metode 2.1. Kemikalije in reagenti Holin klorid, levulinska kislina, 1,2-propandiol, DL-jabolčna kislina, oksalna kislina, klorovodikova kislina in mravljinčna kislina so bili pridobljeni pri Acros Organics (Morris Plains, NJ, ZDA). Mlečna kislina, etilen glikol, glicin, acetonitril stopnje HPLC, metanol in etanol so bili kupljeni pri Fishers Scientific (Waltham, Massachusetts, ZDA). L-prolin in betain hidroklorid sta bila kupljena pri Alfa Aesar (Ward Hill, MA, ZDA). Standardi stopnje HPLC za elaginsko kislino, galno kislino, ferulinsko kislino, (plus)-katehin, (-)-epikatehin, miricetin, kvercetin in kaempferol so bili pridobljeni pri Sigma Aldrich (St. Louis, MO, ZDA).

2.2. Oblikovanje NDESNDES št. 1–2 v tabeli 1 so bili zasnovani v naši prejšnji študiji [14]. Holin klorid v NDES št. 1–2 je bil izbran kot akceptor vodika, medtem ko sta bila za vsak nov NDES izbrana dva različna darovalca vodika. Molarna razmerja med donorji vodika ter akceptorjem in vsebnostjo vode so bila določena v preliminarnih poskusih. NDES št. 3–9 v tabeli 1 so bili izbrani iz literature, saj so jih prejšnje študije označile za učinkovite NDES pri ekstrakciji polifenolov. Vsebnost vode v NDES #3 je bila spremenjena iz citirane literature. Za pripravo NDES je bila uporabljena metoda segrevanja [15]. Na kratko, akceptor vodikove vezi smo zmešali z vsako od komponent donorja vodikove vezi v erlenmajerici z mešalno palico. Zmes v bučki smo zaprli in segrevali pri 50 ◦C približno 30 min ali dokler ni nastala bistra tekočina, ki je ostala stabilna pri sobni temperaturi. Vsebnost vode v tabeli 1 je bila izračunana glede na končni volumen zmesi NDES. pH NDES, naveden v tabeli 1, je bil izmerjen s pH metrom (AB15, Accumet, Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA). 2.3. Priprava vzorca / Ekstrakcija s pomočjo ultrazvoka. Zamrznjene lupine in semena muskadinega grozdja (Vitis rotundifolia) (kultivar: Carlos) so zagotovili Paulk Vineyards (Wray, Georgia, ZDA). Po odstranitvi lupin, listov ali pecljev so tropine ločili na semena in kožo. Vzorci so bili nato posušeni z uporabo vakuumske pečice (Isotemp, Model 285A, Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, ZDA) pri 60 ◦C in vakuumskem tlaku, nižjem od -30 in.Hg. Nato smo vzorce homogenizirali v fin prah z uporabo himernega mlinčka (A1{{105}}00, RRH Inc., 2800 W, Zhejiang, Kitajska). Z uporabo začetnega razmerja med trdno snovjo in topilom 1:20 (g: ml) smo 0,50 g lupine ali pečk grozdja muskadin zmešali v 10 ml NDES ali 75-odstotnega etanola v treh izvodih. Vzorci so bili nato postavljeni v vodno kopel (60 ◦C) in sonikirani (VCX 1500, Sonics & Materials Inc., 1500-Watt, 50/60 Hz, Newtown, CT, ZDA) 30 minut pri 100 odstotkih amplituda za dva kroga (15 min/krog). Nato smo vzorce takoj centrifugirali (Sorvall ST 8, Fisher Scientific, Suzhou, Kitajska) pri 3260 g, dokler nismo dobili bistrega supernatanta. Nazadnje smo zbrali supernatante in jih shranili v zamrzovalniku pri −20 ◦C za analizo HPLC fenolnih kislin (elagična kislina, galna kislina, ferulna kislina), flavonolov (miricetin, kvercetin in kaempferol) in flavan-3-olov. (katehin in epikatehin). 2.4. HPLC analize fenolnih kislin, flavonolov in flavan-3-olov Fenolne kisline, flavonole in flavan-3-ole smo analizirali na sistemu HPLC (Agilent Technologies 1200, Waldbronn, Nemčija) po metodi, opisani v Sandhu in Gu (2013) [16]. Sistem HPLC je sestavljen iz binarne črpalke, samodejnega vzorčevalnika, termostatiranega prostora za kolono, detektorja niza diod in detektorja fluorescence. Ekstrakte grozdnih lupin ali pečk smo hidrolizirali pred analizami fenolnih kislin in flavonolov. Hidrolizo smo izvedli tako, da smo zmešali 1 ml ekstrakta s 4 ml raztopine za hidrolizo (1,2 M HCl, ki vsebuje 50 odstotkov metanola) in postavili v vodno kopel (Precision, model 2837, 400 W, 50/60 Hz, Thermo Scientific, Marietta). , OH, ZDA) pri 90 ◦C 80 minut. Nato smo vzorce ohladili na 25 ◦C, čemur je sledila sonikacija 5 minut. Za analizo katehina in epikatehina hidroliza ekstrakta ni bila potrebna. Hidrolizirane in nehidrolizirane ekstrakte smo pred analizami HPLC filtrirali skozi 0,45 μm politetrafluoroetilensko (PTFE) membrano. Za analizo elaginske kisline, galne kisline, ferulinske kisline, miricetina, kvercetina, kemferola, katehina in epikatehina smo 10 µL vbrizgali v kolono SB-C18 (4,6 × 250 mm, 5 µm, Zorbax, Agilent, Santa Clara, CA, ZDA). Mobilni fazi sta bili (A) 0,5-odstotna mravljinčna kislina in (B) 100-odstotni acetonitril. Hitrost pretoka je bila 1 ml/min s 25-minutnim modificiranim gradientom, kot sledi: 0–5 minut, 10–30 odstotkov B; 5–10 min, 30–40 odstotkov B; 10–20 min, 40–50 odstotkov B; 20–25 min, 50–10 odstotkov B; sledi 5 minut uravnoteženja. Temperaturo kolone smo nastavili na 30 ◦C. Valovna dolžina detekcije je bila 260 nm za elaginsko kislino, galno kislino in ferulinsko kislino ter 360 nm za miricetin, kvercetin in kaempferol na detektorju s fotodiodnimi nizi. Vzbujanje in emisija za katehin in epikatehin sta bila 230 nm oziroma 321 nm z uporabo fluorescenčnega detektorja. Polifenolne spojine so bile kvantificirane z uporabo standardnih krivulj elagične kisline, galne kisline, ferulinske kisline, miricetina, kvercetina, kempferola, katehina in epikatehina. Vse standardne krivulje so imele 7 točk in R2 > 0,99. 2.5. Prilagojena zasnova za umetno nevronsko mreženje Štiri neodvisne ekstrakcijske spremenljivke s štirimi stopnjami: vsebnost vode (15–60 odstotkov), čas ultrazvoka (5–35 min), razmerje med trdno in topilo (1:5–1:20) in ekstrakcija temperaturi (30–60 ◦C) (tabela S1) smo uporabili za optimizacijo izkoristka ekstrakcije fenolnih kislin, flavonolov in flavan-3-olov. Za razliko od klasičnih zasnov, kot je zasnova odzivne površine, zasnova, ki temelji na ANN, ne zahteva ponavljajočih se zagonov in daje prednost drugačni strukturi podatkov. V naši prejšnji študiji [14] je bila ANN bolj zanesljiva metoda za napovedovanje donosa ekstrakcije kot RSM. Zato je bil v tej študiji izbran ANN za napoved izkoristka ekstrakcije elagične kisline, katehina in epikatehina. Prilagojena zasnova s ​​40 izvedbami (tabela S2) je bila ustvarjena na JMP Pro (različica 14.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, ZDA), da se zagotovijo podatki posebej za napovedno modeliranje ANN. Za odpravo morebitne pristranskosti je bila uporabljena randomizacija 40 poskusov. Glavna enačba ANN je prikazana takole:=∑jj=1 wh jpg plus bhk, k=1toK (1) kjer je h število nevronov v skriti plasti, j in k sta število vhodnih spremenljivk oziroma skritih nevronov, p je vhodna spremenljivka, bh je pristranskost skrite plasti in wh je utež v skriti plasti. Izkoristke ekstrakcije elaginske kisline, katehina in epikatehina v povezavi s štirimi neodvisnimi spremenljivkami smo analizirali z uporabo ANN tako, da smo najprej usposobili podatke in nato izbrali najboljšo vrsto aktivacije in število nevronov, kar ima za posledico ustrezno prileganje podatkov. Za ovrednotenje uspeha modelov napovedi so bile ocenjene tri vrednosti: R-kvadrat, kvadratni koren srednje kvadratne napake napovedi (RASE) (enačba (2)) in povprečna absolutna napaka (AAE). RASE je RASE=̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅ SSE/n √ (2) kjer SSE prispeva k kvadratu in vsoti napak napovedi (razlike med dejanskimi in predvidenimi odzivi) in n za številna opazovanja. R-kvadrat blizu 1 z RASE in AAE blizu nič pomeni večje prileganje podatkov modelu. 2.6. Statistika Ekstrakcijske izkoristke fenolnih kislin, flavonolov in flavan-3-olov smo primerjali z enosmerno ANOVA, ki ji je sledil Studentov t-test pri p manj kot ali enako 0,05 z uporabo JMP Pro (različica 14.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, ZDA). Vsak nde in 75-odstotni etanol smo primerjali z Dunnettovimi testi pri p manjšem ali enakem 0,05. Analiza glavnih komponent (PCA) je bila izvedena na JMP Pro (različica 14.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, ZDA) za fenolne spojine, ekstrahirane iz lupine in semena muskadinskega grozdja. 3. Rezultati in razprava 3.1. Polifenoli, ekstrahirani z NDES iz grozdnih lupin muskadin Devet NDES in 75-odstotni etanol so bili uporabljeni za ekstrakcijo polifenolov iz grozdnih kožic muskadin. Tabela 2 prikazuje izkoristek ekstrakcije elagične kisline, galne kisline, ferulinske kisline, miricetina, kvercetina, kemferola, katehina in epikatehina. Elagična kislina je bila najpogostejši polifenol, ki ga je bilo mogoče ekstrahirati v lupini grozdja, sledita ji galna kislina in ferulinska kislina. Ta ugotovitev je bila skladna s prejšnjimi študijami [17,18]. NDES št. 1, št. 8, št. 7, št. 3, št. 2 in št. 9 je izluščil občutno večje količine elaginske kisline v lupini grozdja kot 75-odstotni etanol. Največji izkoristek ekstrakcije elaginske kisline je dosegel NDES #1, ki mu je sledil NDES #8 pri 22,1 ± 2,2 mg/g oziroma 21,3 ± 2,5 mg/g (tabela 2). Vendar pa ni bilo pomembne razlike med NDES #1 in NDES #8 glede na Studentov t-test. Zanimivo je, da je bilo ugotovljeno, da je NDES #1 najmanj učinkovit NDES za ekstrakcijo antocianov

brusnične tropine [14]. To je nakazovalo, da lahko NDES #1 selektivno ekstrahira elaginsko kislino ali elagitanine iz živilskega matriksa, ki vsebuje tudi antocianidine. Takšno selektivnost lahko pripišemo razlikam v molekularnih interakcijah med NDES in specifičnimi fenolnimi razredi. Slika S1 (panel A) prikazuje HPLC kromatogram galne kisline, elagične kisline in ferulinske kisline, ekstrahirane iz lupine grozdja z NDES #1 in zaznane pri 260 nm. 75-odstotni etanol je ekstrahiral 12,7 ± 1,2 mg elaginske kisline na gram lupine grozdja. Najnižji izkoristek ekstrakcije elagične kisline je bil opažen v NDES #4 pri 7,44 ± 0,6 mg/g. Izkoristek ekstrakcije galne kisline z NDES #9, #8, #1, #4, #7 in #3 je bil primerljiv in znatno višji od 75-odstotnega etanola. Največja količina galne kisline je bila ekstrahirana z NDES #9 pri 10,4 ± 0,5 mg/g, medtem ko je bila najmanjša količina 5,55 ± {{40}} .1 mg/g je bil ekstrahiran z NDES #5. Največjo količino ferulinske kisline je ekstrahiral NDES #1 pri 6,32 ± 0,7 mg/g, najmanjšo količino pa je ekstrahiral NDES #5 pri 3,11 ± 0.{{5{{52 }}}} mg/g. Poleg tega ni bilo pomembne razlike med NDES #1 in 75-odstotnim etanolom pri ekstrakciji ferulinske kisline (tabela 2). Največjo količino katehina in epikatehina je ekstrahirala NDES št. 3 pri 0,61 ± 0,1 mg/g in 0,89 ± 0,1 mg/g. g oziroma (tabela 2). Medtem sta NDES #3 in #6 ekstrahirala znatno večje količine epikatehina kot 75-odstotni etanol. Slika S2 (panel A) prikazuje HPLC kromatogram katehina in epikatehina, ekstrahiranega z NDES št. 3 iz lupine grozdja. Vendar katehina v 75-odstotnem etanolnem ekstraktu niso zaznali. Najmanjše količine katehina (0.02 mg/g) in epikatehina ({{90}}.14 mg/g) sta ekstrahirali NDES #2 in NDES # 5 oz. Miricetin je bil najpogostejši flavonol, najmanj pa kaempferol. Dunnettov test je pokazal, da sta bila NDE in 75-odstotni etanol primerljiva pri ekstrakciji miricetina, kvercetina in kaempferola (tabela 2). Največjo količino miricetina je ekstrahiral NDES #1 (1,84 mg/g), sledil je 75-odstotni etanol (1,73 mg/g) in nato NDES #8 (1,67 mg/g). Največja količina kvercetina je bila ekstrahirana s 75-odstotnim etanolom (0,41 mg/g), NDES #1 (0,40 mg/g) in NDES #8 ({ {143}}.38 mg/g). V nasprotju s tem so bile najmanjše količine miricetina in kvercetina ekstrahirane z NDES št. 5 pri 0,87 mg/g oziroma 0,27 mg/g. Ta ugotovitev dodatno poudarja splošno šibko sposobnost NDES #5 za ekstrakcijo polifenolov iz lupine grozdja. Največjo količino kemferola smo ekstrahirali s 75-odstotnim etanolom (0.05 mg/g), najmanjšo pa z NDES #5 in NDES #6 (0,03 mg/g). Slika S1 (panel B) prikazuje kromatogram HPLC miricetina, kvercetina in kemferola, ekstrahiranih iz lupine grozdja z NDES št. 1, zaznan pri 360 nm. Največja skupna količina fenolnih kislin, flavonolov in flavan-3- olov je bila 40,7 mg/g ekstrahiranih z NDES št. 1, čemur je sledilo 39,8 mg/g ekstrahiranih z NDES št. 8, medtem ko je bila najnižja vsota 18,4 mg/g ekstrahiranih po NDES #5 (tabela 2). pH NDES je bil med 0,3 in 3,3 (tabela 1). Korelacija Rsquared med pH NDE in izkoristki fenolnih kislin, flavonolov in flavan-3-olov je bila navedena v tabeli 2. Pomanjkanje korelacije med pH in izkoristkom ekstrakcije je pokazalo, da pH ni vplival na učinkovitost ekstrakcije. 3.2. Polifenoli, ekstrahirani z NDES iz muskadinskih grozdnih pečk Skupni izkoristek ekstrakcije fenolnih kislin, flavonolov in flavan- 3-olov iz grozdnih pečk je bil opazno nižji kot iz lupin (tabela 3). Najpogostejši ekstrahirani polifenoli v semenih so bili katehin in epikatehin, medtem ko kaempferol ni bil odkrit. Kompleksna matrika semena, ki vsebuje olje (13 odstotkov, m/m suha osnova), je možna razlaga za nizko ekstrakcibilnost fenolnih spojin iz grozdnih pečk [19]. Največja količina katehina je bila ekstrahirana z NDES #3 pri 2,77 mg/g (tabela 3). Ta izkoristek je bil znatno višji od vseh drugih NDES in 75-odstotnega etanola. Slika S2 (panel B) prikazuje HPLC kromatogram katehina in epikatehina, ekstrahiranega z NDES #3 iz grozdnih pečk. Najmanjša količina katehina je bila ekstrahirana z NDES #5 pri 0,30 mg/g. Vsi NDES razen NDES št. 1, št. 2 in št. 9 so ekstrahirali znatno večje količine epikatehina kot 75-odstotni etanol (tabela 3). Najvišje koncentracije epikatehina so bile ekstrahirane z NDES #4 (0,71 mg/g) in NDES #5 (0,68 mg/g), najnižje pa s 75-odstotnim etanolom (0,11 mg/g). Galna kislina je bila najbolj razširjena fenolna kislina, ki jo je bilo mogoče ekstrahirati v grozdnih pečkah, sledili sta ji ferulinska kislina in elaginska kislina. Največjo količino galne kisline je ekstrahiral NDES #4 pri 0,45 mg/g, sledita NDES #9 in NDES #8. Ti NDE so ekstrahirali bistveno večje količine galne kisline kot 75-odstotni etanol. Najmanjšo količino galne kisline (0,2 mg/g) ekstrahira NDES #3. Najvišja ekstrakcija

izkoristek elaginske kisline je bil dosežen z NDES št. 9 (0.26 mg/g), ki mu je sledil NDES št. 6 (0.17 mg/g), ki je bil znatno višji od 75-odstotnega etanola. Podobno so NDE št. 3 ekstrahirali najmanjšo količino elaginske kisline pri 0.05 mg/g. Poleg tega so NDES št. 6, št. 7 in št. 3 ekstrahirali znatno večje količine ferulinske kisline kot 75-odstotni etanol. Najnižji izkoristek ekstrakcije ferulinske kisline je bil 0,5 mg/g po NDES #5. Poleg tega ferulinska kislina ni bila odkrita v ekstraktu NDES #9. To je bilo verjetno zato, ker je bila topnost ferulinske kisline manjša v NDES #9 kot v drugih NDE. Največji ekstrakt miricetina je bil pridobljen s 75-odstotnim etanolom in NDES št. 7 pri 0.18 mg/g, kar je bilo višje od vseh NDE. Največji izkoristek ekstrakcije kvercetina je bil pri NDES #6 (0.14 mg/g) in NDES #3 (0,13 mg/g) in oba NDES sta bila boljša od 75-odstotnega etanola. Podobno pH NDES ni vplival na izkoristek ekstrakcije, kot kaže nizka korelacija (R-kvadrat) med pH NDE in izkoristki fenolnih kislin, flavonolov in flavan-3-olov, navedenih v tabeli 3. 3.3 . Analiza glavnih komponent (PCA) je bila izvedena, da bi povezali izkoristek ekstrakcije različnih fenolnih spojin v lupini in semenih grozdja z NDE in 75-odstotnim etanolom (slika 1). PCA je bil izveden na korelacijski matriki, da bi odkrili možno selektivnost nekaterih NDE za ekstrakcijo specifičnih fenolnih spojin ali skupin. Približno 85 odstotkov variance podatkov o koži je bilo pojasnjenih z glavnima komponentama 1 in 2. Graf obremenitve (slika 1B) kaže visoko korelacijo med fenolnimi kislinami (elagična kislina, galna kislina, ferulna kislina) in flavonoli (miricetin, kvercetin, in kempferol). Za ekstrakcijo teh skupin so najboljša topila NDES #1, #8, #7 in 75-odstotni etanol, kot je prikazano na grafu rezultatov (slika 1A). Medtem sta se katehin in epikatehin zdela ločena od ostalih fenolnih skupin. Kot je prikazano na sliki 1A, je bil NDES #3 selektiven za ekstrakcijo katehina in epikatehina iz grozdnih lupin. To je bilo zanimivo opazovanje, ker je bil NDES#3 med najmanj učinkovitimi NDES za ekstrakcijo proantocianidinov, ki so oligomeri in polimeri katehina in epikatehina [14]. To je nakazovalo, da je lahko NDES #3 selektiven za proantocianidine manjših molekulskih velikosti. Grozdenje fenolnih spojin na nakladalni ploskvi lupine (slika 1B) se je razlikovalo od semena (slika 1D), ne glede na nizek izkoristek teh spojin v grozdnih pečkah. Prva in druga glavna komponenta sta pojasnili približno 73 odstotkov variance semenskih podatkov. Kvercetin, miricetin in ferulinska kislina so bili učinkoviteje ekstrahirani z NDES št. 6, št. 7 in 75-odstotnim etanolom, kot je prikazano na grafu rezultatov (slika 1C). Elaginsko kislino in galno kislino sta bili učinkoviteje ekstrahirani z NDES #9. Še enkrat, katehin je bil ekstrahiran z najvišjo učinkovitostjo z NDES #3, ki je bil podoben tistemu, opaženemu pri grozdnih lupinah. Epikatehin je bil ekstrahiran z večjo učinkovitostjo z NDES #5, #4 in NDES #8.

3.4. Optimizacija ekstrakcije fenolnih kislin in flavonolov iz muskadinih grozdnih lupin in modeliranje napovedi ANN. Holin klorid: levulinska kislina: etilenglikol 1:1:2 (NDES #1) je pokazal največji izkoristek ekstrakcije za elaginsko kislino, zato je bil izbran za nadaljnjo optimizacijo in napoved. Za ekstrakcijo fenolnih kislin in flavonolov so bili ocenjeni vplivi štirih dejavnikov, vključno z vsebnostjo vode, časom ultrazvočne obdelave, razmerjem trdne snovi in ​​topila ter temperaturo ekstrakcije. Poleg tega so bile uporabljene štiri ravni za vsak faktor ekstrakcije v skupno 40 naključnih poskusih. Eksperimentalni izkoristek ekstrakcije elagične kisline, galne kisline, ferulinske kisline, miricetina in kvercetina skupaj z vsoto teh petih je prikazan v tabeli 4. Na splošno je bil razpon razlike v izkoristku ekstrakcije med najnižjo in najvišjo sorazmerno velik za fenolne kisline. Najnižji izkoristek elagične kisline je bil na primer 9.03 mg/g (17. postopek), najvišji pa 25,3 mg/g (15. postopek), kar je povzročilo razliko 16,2 mg/g (izvedba št. 17). Poleg tega je bila najnižja vsota donosa 20,7 mg/g, najvišja pa 71,5 mg/g. To ponazarja pomembne vplive različnih ravni vsakega ekstrakcijskega faktorja na izkoristek ekstrakcije. Potek št. 15 je ekstrahiral največjo količino elaginske kisline. Pogoj ekstrakcije v seriji #15 je bil 45 mL /10{{130}} mL vsebnosti vode, 25 minut ultrazvočne obdelave, 1:10 (g: mL) razmerje med trdno snovjo in topilo in temperaturo ekstrakcije 60 ◦C. Slika S3 prikazuje HPLC kromatogram optimiziranih fenolnih kislin, ekstrahiranih iz lupine grozdja z NDES št. 1 (potek št. 15 v tabeli 4). Najvišja vrednost galne kisline (18,7 mg/g) je bila dosežena z uporabo ekstrakcijskih pogojev v postopku št. 24, najnižja pa je bila 6,63 mg/g z uporabo postopka št. 40. Za ferulinsko kislino je bila v seriji št. 22 ekstrahirana največja količina pri 19,2 mg/g, medtem ko v serijah št. 14, št. 17, št. 29 in št. 34 ni bila zaznana ferulna kislina. Potek št. 22 je bil ekstrahiran z vsebnostjo vode 60 mL /100 mL, 5 min ultrazvočne obdelave, 1:5 za razmerje med trdno in topilo ter temperaturo ekstrakcije 60 ◦C. Potek št. 2 je ekstrahiral največ miricetina (10,1 mg/g) in kvercetina (1,87 mg/g). Pogoji ekstrakcije v teku št. 2 so bili 60 mL /100 mL vsebnosti vode, 35 minut ultrazvočne obdelave, 1:20 za razmerje med trdno snovjo in topilom in temperatura ekstrakcije 60 ◦C. Najnižji moj gotov izkoristek (3,79 mg/g) je bil ekstrahiran s postopkom #40. Konturne ploskve na sliki 2 prikazujejo učinek ekstrakcijskih parametrov (X1, X2, X3 in X4) na predvideni izkoristek elaginske kisline, ekstrahirane z NDES #1 iz lupine grozdja. Predvideni izkoristki elaginske kisline v tabeli 4 so bili uporabljeni za izdelavo teh grafov štetja. Vsaka plošča ponazarja vpliv dveh parametrov ekstrakcije. Konturne črte so označene z izkoristkom elaginske kisline (mg/g). Optimalna predvidena vsebnost vode je bila približno 35–45 ml/100 ml NDES, kot je prikazano na slikah 2B in 2C. Daljši čas ultrazvočne obdelave je povečal izkoristek elaginske kisline (sl. 2D in 2E), kar kaže na kritično vlogo ultrazvočne obdelave pri ekstrakciji NDES. Med ekstrakcijo je mešanje grozdnih lupin ali pečk z NDES vneslo delce in plin, kar je dodalo mesta akustične kavitacije za ultrazvok, ki je ustvaril številne majhne mehurčke v NDES. Impplozija teh mehurčkov je privedla do ekstremne temperature, razlike v tlaku, visoke strižne sile, makro-turbulenc in mikro-mešanja, kar je učinkovito vznemirilo NDES za pospešitev difuzije in prenosa mase. Ko so kavitacijski mehurčki implodirali na površino grozdnih pečk ali delcev lupine, so nastali mikro curki in trki med delci povzročili površinsko luščenje, erozijo, razgradnjo delcev, sonoporacijo in motnje celic [20]. Vsi ti mehanski učinki z ultrazvokom povzročene kavitacije so okrepili prodiranje NDE v notranjost celice, tako da so medcelični fenoli iz živilskega matriksa prešli v topila. Optimalno razmerje trdne snovi in ​​topila je bilo 1:10, kot je prikazano na slikah 2B, 2D in 2F. Nazadnje se zdi, da višje temperature ekstrakcije do 60 ◦C pozitivno vplivajo na ekstrakcijo elagične kisline, kot je prikazano na slikah 2C, 2E in 2F. To kaže na neposredno povezavo med temperaturo ekstrakcije in izkoristkom elaginske kisline, ekstrahirane iz lupine grozdja. Donos ekstrakcije elagične kisline (tabela 4) je bil analiziran za napovedno modeliranje z uporabo umetnega nevronskega mreženja. Eksperimentalni podatki so bili naključno razdeljeni v niz za usposabljanje in niz za validacijo. Razlog za vključitev validacije, ki jo je nastavila statistična programska oprema, je zatiranje prekomernega opremljanja. Za napovedovanje izkoristka elagične kisline (Y) so bili ocenjeni isti štirje neodvisni faktorji ekstrakcije (X1, X2, X3 in X4), 1–2 skriti plasti z različnim številom nevronov in tri aktivacijske funkcije. Uporabljene aktivacijske funkcije so bile hiperbolični tangens, linearna in gaussova. Nato so bili nabori podatkov usposobljeni, dokler ni bila dosežena visoka vrednost R-kvadrata za usposabljanje in validacijo. Ustvarjeni so bili napovedni podatki in model. Najboljša struktura ANN je bila izbrana z analizo štirih vhodov (X1, X2, X3 in X4) z eno skrito plastjo z uporabo Gaussove funkcije z desetimi nevroni (slika S5). R-kvadrat nizov za usposabljanje in validacijo je bil 0,99, medtem ko sta bila RASE in AAE modela 0,062 oziroma 0,044. R-kvadrat validacije ANN elagične kisline v tej študiji (0,99) je bil višji od validacije ANN procianidinov (0,95) in antocianinov (0,91) v prejšnji študiji [14]. Vendar pa je to povečanje R2 mogoče pripisati boljšemu ustvarjenemu modelu, ki ustreza podatkom v tej študiji, kar je lahko posledica manjših eksperimentalnih napak. Napovedni modeli ANN za ekstrakcijo elaginske kisline z uporabo NDES #1 so bili prikazani kot enačba 3–13:

Cistanche za izboljšanje imunosti

Zaključek

Trenutne ugotovitve so predstavile nadaljnje dokaze o učinkovitosti sposobnosti NDES za ekstrakcijo polifenolov iz stranskih proizvodov živilske industrije. Rezultati so podprli hipotezo o boljši ekstrakciji NDES s pomočjo ultrazvoka nad 75 odstotki etanola. NDES je učinkovito ekstrahiral tri fenolne kisline, dva flavonola in tri flavan{3}}ole iz grozdnih lupin in pečk. NDES #1 je bil najučinkovitejši NDES za ekstrakcijo elagične kisline, medtem ko je bil NDES #3 izrazito selektiven za ekstrakcijo katehina in epikatehina. Opazna pomanjkljivost NDES je njihova visoka viskoznost, ki predstavlja izziv med rokovanjem in predelavo. V tej študiji je umetno nevronsko mreženje ne glede na omejitve rezultatov pokazalo praktičen pristop za napovedno modeliranje. NDE so robustni mediji za pridobivanje fitokemikalij iz prehranskih sistemov. Nekateri NDE predstavljajo tudi manj strupeno topilo za preučevanje teh fitokemikalij v živih celicah [21, 22]. Končno so naravna globoko evtektična topila učinkovita alternativna ekstrakcijska sredstva organskim topilom.

Reference

[1] W. Bi, M. Tian, ​​KH Row, Vrednotenje globokega evtektičnega topila na osnovi alkohola pri ekstrakciji in določanjuflavonoidiz optimizacijo metodologije odzivne površine, J. Chromatogr. A 1285 (2013) 22–30, https://doi.org/10.1016/j. barvnost.2013.02.041.
[2] M. Cvjetko Bubalo, N. ´ Curko, M. Tomaˇsevi´c, K. Kovaˇcevi´c Ghani's, I. Radojˇci´c Redovnikovi´c, Green extraction of grape lupin phenolics by using deep eutectic solvents, Food Chem. 200 (2016) 159–166, https://doi.org/10.1016/j. foodchem.2016.01.040.
[3] M. Panic, V. Gunjevi´c, G. Cravotto, I. Radojˇci´c Redovnikovi´c, Omogočanje tehnologij za ekstrakcijo antocianov iz grozdnih tropin z uporabo naravnih globokih evtektičnih topil v do pollitrskih serijah. ekstrakcija antocianinov iz grozdnih tropin z uporabo NADES, Food Chem. 300 (2019) 125185, https://doi.org/ 10.1016/j.foodchem.2019.125185.
[4] M. Hoffmann, et al., Priročnik za pridelavo muškatnega grozdja za jugovzhod, Državna univerza Severne Karoline, NC State Extension Publications, 2020 https://content. ces.ncsu.edu/muscadine-grape-production-guide (dostopano 18. januarja 2021). [5] Cline, B. in C. Fisk, Pregled površin, kultivarjev in pridelovalnih območij grozdja muscadine v jugovzhodnih ZDA. Delavnica Muscadine Grape za zadruge za razširitev, v konzorciju za drobno sadje južne regije. 2006: Konzorcij drobnega sadja južne regije.
[6] PC Andersen A. Sarkhosh D. Huff J. Breman 2020 6 10.32473/edis-hs100-2020.
[7] P. Greenspan, et al., Protivnetne lastnosti vinske trte (Vitis rotundifolia), J. Agric. hrana. Chem. 53 (22) (2005) 8481–8484, https://doi.org/ 10.1021/jf058015.
[8] DN Ignacio, KD Mason, EC Hackett-Morton, C. Albanese, L. Ringer, WD Wagner, PC Wang, MA Carducci, SK Kachhap, CJ Paller, J. Mendonca, L. Li Ying Chan, Bo Lin, DK Hartle, JE Green, CA Brown, TS Hudson, Ekstrakt grozdne lupine Muscadine zavira celice raka prostate tako, da inducira zaustavitev celičnega cikla in zmanjša migracijo preko proteina toplotnega šoka 40, Heliyon 5 (1) (2019) e01128, https://doi .org/10.1016/j.heliyon.2019.e01128.