In vitro vrednotenje fotoreaktivnosti in fototoksičnosti naravnih polifenolnih antioksidantov

Prosim kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comvedeti več.

Povzetek:Polifenoli so velika družina naravnih spojin, ki se pogosto uporabljajo v kozmetičnih izdelkih zaradi svojih antioksidativnih in protivnetnih koristnih lastnosti ter sposobnosti preprečevanja oksidativnega stresa, ki ga povzroča UV sevanje. Ker te spojine predstavljajo kromofore in se nanašajo neposredno na kožo, lahko reagirajo s sončno svetlobo in imajo fototoksične učinke. Razpoložljivih znanstvenih informacij o fototoksičnem potencialu teh naravnih spojin je malo, zato je bil cilj te študije oceniti fotoreaktivnost in fototoksičnost petih fenolnihantioksidantiz dokumentirano uporabo v kozmetičnih izdelkih. Standardni ROS test je bil potrjen in uporabljen za pregled fotoreaktivnosti naravnih fenolnih antioksidantov kofeinske kisline, ferulinske kisline, p-kumarinske kisline, 3,4-dihidroksifenilocetne kisline (DOPAC) in rutina. Potencial fototoksičnosti je bil določen z uporabo celične linije človeških keratinocitov (HaCaT) na podlagi testa fototoksičnosti 3T3 Neutral Red Uptake. Čeprav vseproučevali fenolne antioksidanteabsorbiranega UV/Vis sevanja v območju od 290 do 700 nm, je samo DOPAC lahko ustvaril singletni kisik. Nastajanje reaktivnih kisikovih spojin je kemijska reakcija v zgodnji fazi kot del mehanizma fototoksičnosti. Vendar pa nobena od proučevanih spojin ni zmanjšala viabilnosti keratinocitov po obsevanju, kar vodi do zaključka, da nimajo fototoksičnega potenciala. Podatki, pridobljeni s tem delom, kažejo, da so te spojine varne, če jih vključimo v kozmetične izdelke.

Ključne besede:varnost fotografij; fotoreaktivnost; fototoksičnost; polifenoli;naravni fenolni antioksidanti; reaktivne kisikove spojine; keratinociti; nega kože; kozmetični izdelki

Za več informacij kliknite tukaj

Uvod 

Polifenoli (PP) predstavljajo eno najštevilčnejših in najbolj razširjenih skupin naravnih proizvodov v rastlinskem kraljestvu. Za kemijsko strukturo PP je značilna prisotnost ene ali več fenolnih hidroksilnih skupin, vezanih na enega ali več benzenovih obročnih sistemov [1]. Polifenoli izkazujejo vrsto koristnih bioloških aktivnosti pri ljudeh, vključno z protivirusnim, antibakterijskim, antikancerogenim, hepatoprotektivnim, protivnetnim in antioksidativnim delovanjem [2–5].Kot antioksidanti, lahko polifenoli zaščitijo celične sestavine pred oksidativnimi škodljivimi učinki reaktivnih kisikovih vrst (ROS), kot so singletni kisik, superoksid in hidroksilni radikali, kar omejuje tveganje za več bolezni, povezanih z oksidativnim stresom [6,7]. Zaradi svojih kemijskih lastnosti so PP sposobni loviti ROS in kelirati ione prehodnih kovin, kot sta železo in baker, kar je pritegnilo zanimanje kozmetične industrije za njihovo uporabo v formulacijah za nego kože [8–10]. Izpostavljenost ultravijoličnim (UV) žarkom je eden od glavnih dejavnikov, ki povzročajo kožnega raka, kožne celice pa lahko poškoduje neposredno UV sevanje ali posredno prekomerna proizvodnja ROS, ki jo posreduje UV [11]. Eksperimentalne in epidemiološke študije so pokazale, da polifenoli ščitijo kožo pred škodljivimi učinki UV sevanja na več načinov [12]. Zato se več spojin iz te družine že uporablja kot sestavine v številnih komercialnih kozmetičnih izdelkih, ki so na voljo na trgu [13]. Povečano povpraševanje potrošnikov po naravni kozmetiki je industrijo spodbudilo k razvoju formulacij, ki uporabljajo naravne izvlečke z aktivnimi sestavinami, kot so polifenoli, kot obetavno in učinkovito rešitev za nego kože [13]. Vendar imajo kromoforji, ki so prisotni v strukturi polifenolov, sposobnost absorbiranja UV/Vis sevanja in so podvrženi kemičnim reakcijam, ki povzročijo kaskado dogodkov, ki lahko povzročijo fototoksične reakcije [14]. Fototoksičnost je opredeljena kot toksični odziv, ki ga izzovejo lokalno ali sistemsko dane fotoreaktivne kemikalije po izpostavitvi telesa okoljski svetlobi [15]. Farmacevtske učinkovine in pomožne snovi za sistemsko uporabo, klinične formulacije za lokalno uporabo, dermalni obliži in drugi imajo fototoksični potencial in lahko povzročijo opazne fototoksične reakcije. Posledično regulativne agencije, ameriška FDA, EU EMA in ICH, zagotavljajo smernice za varnost fotografij, ki uvajajo testne metode in strategije ocenjevanja [15–17]. Ocena varnosti kozmetičnih izdelkov je obvezna po zakonodaji Evropske unije [18]. Zahtevana ocena varnosti vključuje ustrezne toksikološke študije kozmetičnih sestavin, vključno z oceno foto-inducirane toksičnosti [18]. Ker je bilo testiranje kozmetičnih izdelkov na živalih prepovedano, so bili v zadnjih letih predlagani številni testi varnosti fotografij in vitro, vključno z analizo UV-spektra, testom fototoksičnosti 3T3 Neutral Red Uptake (3T3 NRU PT) in reaktivnimi kisikovimi spojinami ( ROS) [18–20]. Test ROS je bil zasnovan za oceno fotoreaktivnosti zdravil, katerega princip je spremljanje fotokemičnih reakcij v preskusnih kemikalijah, izpostavljenih simulirani sončni svetlobi [19,20]. S temi fotokemičnimi reakcijami lahko nastanejo ROS, kot sta superoksidni anion in singletni kisik, ti ​​fotokemični procesi pa so lahko sprožilec fototoksičnosti, ki jo povzročajo zdravila [19, 20]. Visoke ravni ROS lahko povzročijo citotoksičnost zaradi poškodbe DNA, lipidov in beljakovin zaradi oksidativnega stresa.https://www.voachinese.com/a/us-lawmakers-united-condemn-russias-ukraine-invasion-20220224/6458599.htmlMetodologija in vitro 3T3 NRU-PT uporablja celično linijo mišjih fibroblastov Balb/c 3T3 in privzem nevtralnega rdečega kot končno točko citotoksičnosti. Fototoksičnost se nato določi z relativnim zmanjšanjem sposobnosti preživetja celic, izpostavljenih preskusni kemikaliji v prisotnosti in odsotnosti svetlobe, ki simulira sončno svetlobo. Študije, objavljene v literaturi, so pokazale, da je ta test preobčutljiv, saj napačno napoveduje varnostna tveganja pri fotografiranju živali in ljudi, kar vodi do velikega števila lažno pozitivnih rezultatov v primerjavi z rezultati in vivo [21–23]. Glede na to omejitev je naša skupina predlagala modifikacijo metodologije 3T3 NRU-PT, ki temelji na uporabi celične linije človeških keratinocitov (HaCaT) [24]. Ker ta metodologija uporablja celice človeških keratinocitov, predstavlja bolj realističen model, glede na to, da so te najbolj razširjene vrste celic, ki so prisotne v zunanji plasti kože, kjer se nanašajo topikalne spojine in so izpostavljene sončnemu sevanju [24]. Namen te študije je bil oceniti potencial foto-inducirane toksičnosti naravnih polifenolov p-kumarinske kisline, kofeinske kisline, 3,4-dihidroksifenilocetne kisline (DOPAC), ferulne kisline in rutina (slika 1), ki se že uporabljajo kot kozmetične sestavine ali pa se o njih razmišlja zaradi njihovih zanimivih kemičnih in antioksidativnih lastnosti [25–27]. Test ROS je bil potrjen in izveden za raziskovalno fotografsko oceno varnosti spojin, njihova citotoksičnost in fototoksičnost pa sta bili nadalje ocenjeni z uporabo celične linije človeških keratinocitov (HaCaT).

2. Rezultati in razprava 

Začetni premislek za oceno fotoreaktivnega potenciala je, ali spojina absorbira fotone pri kateri koli valovni dolžini med 290 in 700 nm. Spojina, ki ima molski ekstinkcijski koeficient (MEC) večji od 1000 L mol−1 cm−1 pri kateri koli valovni dolžini med 290 in 700 nm, velja za dovolj fotoreaktivno, da povzroči neposredno fototoksičnost [15]. Absorpcijski spektri kofeinske, p-kumarne in ferulinske kisline, DOPAC in rutina v DMSO pri UV-vidni svetlobi so prikazani na sliki 2. Vse spojine absorbirajo v spektralnem območju od 200 do 700 nm, z največjo valovno dolžino pri oz. nad 290 nm in z MEC običajno večjim od 4000 L mol−1 cm−1 (tabela 1). Polifenoli so biološke spojine, ki vsebujejo π konjugirane sisteme s fenolnimi hidroksilnimi skupinami. Elektronski prehodi molekularnih orbital tipa π so odgovorni za UV-vidni spekter te skupine spojin [28]

Vse testirane spojine so imele MEC višje od 1000 L mol−1 cm−1, kar pomeni, da so vse možne fototoksične spojine, ki jih je vredno preučiti [15]. Pred izvedbo testa ROS je bil ovrednoten sončni simulator in eksperimentalni pogoji so bili optimizirani, da so bile izmerjene vrednosti singletnega kisika (SO) in superoksidnega aniona (SA) blizu tistim, omenjenim v literaturi [29]. Optimizacija testa nastajanja ROS je bila izvedena z uporabo pozitivnih in negativnih kontrol, študija izvedljivosti pa je bila izvedena z uporabo referenčnih kemikalij. Pod uporabljenimi eksperimentalnimi pogoji so vse snovi, preizkušene v študiji izvedljivosti, izpolnjevale merila sprejemljivosti, ki dajejo vrednosti za SO in SA znotraj dopustnih razponov vrednosti [29].

Test ROS je bil izveden za polifenolne spojine in sposobnost testiranih snovi za tvorbo ROS pri koncentraciji 200 µM je prikazana v tabeli 2. Tabela 2. Rezultati so bili pridobljeni za testirane spojine z uporabo testa ROS.

Dobljeni rezultati kažejo, da lahko vse spojine z izjemo DOPAC uvrstimo med fotoreaktivne. Čeprav so te snovi pokazale absorpcijo UV-vidne svetlobe in MEC višje od 1000 L mol−1 cm−1, v testiranih pogojih niso ustvarile ROS, niti vrste SO niti SA. Presenetljivo je DOPAC lahko induciral nastanek vrst SO in je bil zato razvrščen kot fotoreaktiven, kljub temu, da ima ta spojina najnižjo vrednost MEC v UV-vidnem območju med vsemi proučevanimi spojinami. Za razumevanje rezultatov, pridobljenih za DOPAC, je potrebnih več študij, kar bi lahko bilo v bližnji prihodnosti pomembno tudi za vzpostavitev korelacije med kemijsko strukturo spojine in njeno sposobnostjo, da je fotoreaktivna. Citotoksičnost DMSO, uporabljenega za oceno fototoksičnih učinkov, v prisotnosti in odsotnosti obsevanja, je bila ocenjena po 1 uri izpostavljenosti. Za neobsevano ploščo DMSO ni pokazal statistično pomembne razlike glede na negativne kontrole. Vendar pa je bila za obsevano ploščo pomembna razlika med 1-odstotnim DMSO in kontrolo s topilom glede na negativne kontrole (p < 0,0001),="" kar="" je="" upravičilo="" uporabo="" kontrole="" s="" topilom="" pri="" vseh="" poskusih,="" da="" se="" zagotovi,="" da="" razlike="" v="" sposobnosti="" preživetja="" celic="" so="" bile="" pripisane="" le="" preučevanim="" spojinam.="" da="" bi="" zagotovili="" izvedljivost="" testa="" fototoksičnosti="" z="" uporabo="" celične="" linije="" človeških="" keratinocitov="" (hacat),="" so="" 5-metoksi="" psoralen,="" klorpromazin="" hidroklorid="" in="" kinin="" testirali="" kot="" pozitivne="" kontrole,="" acetilsalicilno="" kislino,="" heksaklorofen="" in="" natrijev="" lavril="" sulfat="" pa="" kot="" negativne="" kontrole="" [24].="" rezultati,="" dobljeni="" s="" preizkusom="" fototoksičnosti,="" ki="" primerja="" viabilnost="" celic="" hacat,="" obsevanih="" in="" neobsevanih,="" v="" prisotnosti="" testiranih="" (poli)fenolnih="" spojin,="" so="" prikazani="" na="" sliki="" 3.="" območja="" koncentracij="" kemikalij,="" testiranih="" v="" prisotnosti="" (irr="" plus="" )="" in="" odsotnost="" (irr−)="" svetlobe="" sta="" bili="" določeni="" v="" poskusih="" za="" določanje="" razpona="" odmerka,="" pri="" čemer="" je="" bila="" upoštevana="" največja="" koncentracija="" 1000="" µm.="" uporabljena="" je="" bila="" serija="" geometrijskih="" razredčitev,="" ki="" je="" bila="" po="" potrebi="" prilagojena="" kot="" funkcija="" koncentracije-odziva="" v="" prisotnosti="" in="" odsotnosti="" obsevanja.="" znotraj="" testiranega="" območja="" koncentracij="" (12,5;="" 31,25;="" 62,5;="" 125;="" 250;="" 500="" in="" 1000="" µm)="" nobena="" od="" testiranih="" snovi="" ni="" povzročila="" 50-odstotnega="" zmanjšanja="" viabilnosti="" celic,="" zato="" ni="" bilo="" mogoče="" izračunati="" ustreznih="" vrednosti="" ic50="" in="" pif.="" .="" nasprotno,="" mogoče="" je="" bilo="" zaznati="" od="" odmerka="" odvisno="" povečanje="" viabilnosti="" obsevanih="" celic="" v="" prisotnosti="" testiranih="" snovi,="" verjetno="" zaradi="" fotozaščitnih="" učinkov="" teh="" antioksidantov="" proti="" oksidativnim="" poškodbam,="" ki="" jih="" povzroča="" sevanje,="" kar="" vodi="" do="" višjega="" odstotka="" živih="" celic="" v="" primerjavi="" s="" kontrolo="" (neobdelane="" obsevane="" celice).="" v="" literaturi="" je="" opisano,="" da="" uv-sevanje="" povzroči="" nastanek="" ros,="" prekomerno="" proizvodnjo="" dušikovega="" oksida="" in="" izčrpanost="" antioksidativne="" obrambe="" v="" keratinocitih="" [30].="" iz="" teh="" razlogov="" so="" polifenole="" z="" antioksidativno="" sposobnostjo="" proučevali="" kot="" fotozaščitna="" sredstva.="" čeprav="" se="" je="" večina="" študij="" osredotočala="" na="" fotozaščitno="" sposobnost="" polifenolov,="" niso="" proučevali="" njihovega="" fototoksičnega="" potenciala.="" prejšnje="" študije="" so="" potrdile="" sposobnost="" kofeinske,="" ferulinske="" in="" p-kumarinske="" kisline="" za="" odstranjevanje="" ros="" in="" reaktivnih="" dušikovih="" vrst="" (rns).="" poleg="" tega="" je="" bila="" za="" te="" tri="" fenolne="" spojine="" in="" vivo="" ali="" kožne="" celice="" ugotovljena="" tudi="" zaščita="" pred="" škodljivimi="" učinki="" uv-sevanja="" [31–34].="" ti="" podatki="" lahko="" pojasnijo="" povečanje="" odstotka="" živih="" celic,="" kadar="" so="" izpostavljene="" obsevanju="" v="" prisotnosti="" proučevanih="" spojin.="" rutin,="" tako="" kot="" kofeinska,="" ferulinska="" in="" p-kumarinska="" kislina,="" je="" bil="" v="" testu="" generiranja="" ros="" negativen="" in="" ni="" povzročil="" fototoksičnosti="" v="" celični="" liniji="" hacat.="" v="" literaturi="" je="" nekaj="" protislovnih="" informacij="" glede="" fototoksičnega="" potenciala="" rutina,="" zato="" so="" dobljeni="" rezultati="" zanimivi.="" ocena="" fototoksičnega="" potenciala="" z="" uporabo="" keratinocitnega="" celičnega="" sistema="" (hacat)="" je="" pokazala,="" da="" je="" rutin="" pokazal="" fototoksičnost="" [35].="" nasprotno,="" z="" uporabo="" eksperimentalne="" postavitve,="" ki="" uporablja="" kapilarno="" elektroforezo="" z="" elektrokemijsko="" in="" uv="" detekcijo="" za="" testiranje="" fototoksičnosti="" rastlinskih="" izvlečkov="" in="" komponent="" v="" smislu="" porabe="" kisika="" in="" tvorbe="" reaktivnih="" kisikovih="" spojin="" po="" obsevanju="" z="" vidno="" svetlobo,="" je="" bilo="" mogoče="" zaključiti,="" da="" je="" bil="" rutin="" ni="" fototoksičen="" [36],="" kar="" je="" bilo="" v="" skladu="" z="" rezultati,="" pridobljenimi="" v="" tem="" delu,="" kjer="" rutin="" ni="" pokazal="" fotoreaktivnosti,="" saj="" ni="" ustvaril="" niti="" so="" niti="" sa="" v="" testu="" generiranja="" ros.="" po="" drugi="" strani="" pa="" je="" bilo="" v="" tem="" delu="" tudi="" dokazano,="" da="" rutin="" sam="" po="" sebi="" ne="" predstavlja="" fototoksičnega="" potenciala="" v="" celični="" liniji="" hacat.="" te="" protislovne="" ugotovitve="" poudarjajo="" pomen="" uporabe="" standardiziranih="" preskusnih="" pogojev="" in="" tudi="" uporabe="" ustreznega="" vira="" svetlobe,="" da="" bi="" se="" izognili="" zavajajočim="" rezultatom.="" zanimivo="" je,="" da="" je="" kljub="" strukturni="" podobnosti="" med="" dopac="" in="" drugimi="" proučevanimi="" pp="" dopac="" ustvaril="" so="" v="" testu="" generiranja="" ros="" in="" je="" bil="" razvrščen="" kot="" fotoreaktiven.="" vendar="" se="" je="" pri="" testiranju="" na="" celični="" liniji="" hacat="" izkazalo,="" da="" dopac="" ni="" fototoksičen.="" iz="" dobljenih="" rezultatov="" se="" zdi,="" da="" je="" dopac="" fotoreaktiven,="" vendar="" ne="" fototoksičen,="" zato="" ni="" pričakovati,="" da="" bi="" se="" po="" lokalni="" uporabi="" te="" spojine="" pojavile="" fototoksične="">

3. Materiali in metode

3.1. Reagenti

3,4-dihidroksifenilocetna kislina (DOPAC), kofeinska kislina, trans-ferulinska kislina, p-kumarinska kislina, rutin, klorpromazin hidroklorid, dinatrijev hidrogenfosfat dodekahidrat, natrijev fosfat monobazični monohidrat, nevtralno rdeče (NR) in dimetil sulfoksid (DMSO) so bili kupljeni pri Sigma-Aldrich (Madrid, Španija). Kinin hidroklorid, benzokain, diklofenak in eritromicin so bili kupljeni pri Acofarma (Madrid, Španija). Imortalizirana celična linija človeških keratinocitov (HaCaT) je bila pridobljena iz Cell Lines Service (CLS) (Eppelheim, Nemčija). Dulbeccovo modificirano gojišče Eagle (DMEM) s 4,5 g/L D-glukoze, L-glutamina, 25 mM HEPES in DMEM s 4,5 g/L D-glukoze, L glutamina, 25 mM HEPES brez fenol rdečega, Dulbeccova fiziološka raztopina s fosfatnim pufrom (DPBS), fetalni goveji serum (FBS) in tripsin EDTA so bili kupljeni pri Gibco Life Technologies (Waltham, MA, ZDA). Etanol je dobavilo podjetje Aga (Lizbona, Portugalska). N, N-dimetil-4-nitrogvanidin (RNO), imidazol in nitro modri tetrazolij (NBT) so bili kupljeni pri Alfa Aesar (Kandel, Nemčija).

3.2. Spektralna absorpcija 

Absorpcijski spekter vsake proučevane spojine je bil določen v območju od 290 do 700 nm, v skladu s smernico OECD Test Guideline 101, z uporabo spektrofotometra Jasco V650 UV/VIS [37]. Snovi smo raztopili v DMSO, da smo dobili končno koncentracijo 10 µg/mL in izmerili absorpcijske spektre z uporabo UV-prosojnih kvarčnih kivet (dolžina poti=10 mm). Vsak spekter je bil popravljen za osnovno absorpcijo topila. Koeficient molarne ekstinkcije (MEC) je bil izračunan z uporabo najvišjih absorpcijskih vrhov od 290 do 700 nm [15].

3.3. Test reaktivnih kisikovih vrst (ROS). 

Vzpostavljen je bil protokol za analizo ROS in validacijske študije so bile izvedene v skladu s postopkom, opisanim v literaturi [19, 29]. Založne raztopine vseh testiranih snovi smo pripravili v koncentraciji 10 mM v DMSO in jih uporabili še isti dan, zaščitene pred svetlobo. Na kratko, nastajanje singletnega kisika (SO) je bilo odkrito s spektrofotometričnim merjenjem beljenja p-nitrozodimetilanilina (RNO) pri 440 nm z uporabo imidazola kot selektivnega akceptorja singletnega kisika. Vzorce, ki so vsebovali testirano kemikalijo (200 µM), RNO (50 µM) in imidazol (50 µM) v 20 mM natrijevega fosfatnega pufra (PB, pH 7,4), smo dali v epruveto in zmešali z vrtinčnim mešalnikom ter sonikirali, zaščiteno pred svetlobo, 10 min. Mešanico smo prenesli v Hellma visoko zmogljivo celico iz kremenčevega stekla in pod mikroskopom preverili obarjanje pred izpostavitvijo svetlobi. Nato so bili vzorci obsevani s termostatskim sončnim simulatorjem Fitoclima S600PL (Aralab, Portugalska), opremljenim z osmimi Repti Glo (20 W) UV-Vis žarnicami, 90 minut pri 25 ◦C. Po obsevanju smo ponovno odčitali absorbanco pri 440 nm. Nastajanje superoksidnega aniona (SA) je bilo odkrito z opazovanjem redukcije nitromodrega tetrazolija (NBT) v monoformazan (NBT plus), katerega tvorbo je mogoče spremljati spektrofotometrično pri 560 nm. Vzorci, ki so vsebovali testirane spojine (200 µM) in NBT (50 µM) v 20 mM NaPB, so bili obsevani, zmanjšanje NBT pa izmerjeno s povečanjem absorbance pri 560 nm na enak način kot pri določanju SO. Poskusi so bili izvedeni v treh izvodih. Ker je bil uporabljeni sončni simulator drugačen od priporočenih modelov, je bilo treba potrditi pogoje obsevanja. Opravljen je bil test ROS, da se zagotovi, da pogoji obsevanja izpolnjujejo priporočena merila z uporabo pozitivnih (kinin) in negativnih kontrol (sulisobenzon) ter referenčnih kemičnih spojin [29]. Glede na rezultat (srednja vrednost trojnih določitev) iz testa ROS so bile testirane polifenolne spojine razvrščene kot fotoreaktivne snovi, ko je bila izmerjena vrednost SO 25 ali več in/ali vrednost SA 20 ali več; po drugi strani pa je bila določena kot nefotoreaktivna snov, ko so bile zabeležene vrednosti manj kot 25 za SO in manj kot 20 za SA [29].

3.4. Celična kultura 

Celice HaCaT smo vzdrževali pri 37 ◦C v vlažni atmosferi s 95 odstotki zraka in 5 odstotki CO2 v inkubatorju v DMEM z 10 odstotki FBS in 1 odstotkom antibiotikov. Z invertnim mikroskopom so opazili celično sotočje in če so celice dosegle 70–80-odstotno sotočje, so izvedli subkulturo, da bi preprečili celično smrt. V ta namen smo gojišče odsesali, celice sprali z DPBS, dodali 2 mL 0,25 odstotnega tripsina in inkubirali 7 do 8 minut pri 37 ◦C v atmosferi 5 odstotkov CO2. Po ločitvi celic smo dodali svež medij, da blokiramo delovanje tripsina. Za štetje celic smo 10 µL celične suspenzije dali v Neubauerjevo komoro, kjer smo prešteli celice. Dobljeno celično suspenzijo smo nato razdelili v nove bučke s svežim medijem celične kulture. Za zamrzovanje celic je bil kot kriokonzervans uporabljen DMSO (5 odstotkov v/v), da se prepreči nastajanje kristalov med fazo shranjevanja. Da bi določili čas, potreben za podvajanje celic, smo 1 × 106 celic zasejali v pet 75 cm2 bučk in jih inkubirali 24 ur pri 37 °C v 5-odstotni atmosferi CO2, da smo dosegli popolno oprijemljivost. Nato smo celice vsake bučke prešteli ob različnih časih. Rezultati so bili narisani v grafičnem prikazu števila celic v odvisnosti od časa, iz katerega je bil z uporabo linearne regresijske analize izračunan čas podvojitve. Dobljeni izračunani čas podvojitve je bil 20,43 h, kar je skladno z vrednostmi, navedenimi v literaturi, kar potrjuje, da so bile uporabljene celice v normalnih pogojih rasti [38]. 3.5. Test fototoksičnosti Za študijo fototoksičnosti smo upoštevali predhodni protokol, ki smo ga izvajali v našem laboratoriju [24]. Višina UVA/UVB žarnice Osram (240V E27) je bila prilagojena za obsevanje celic z dozo obsevanja UVA 1,7 mW/cm2 (radiometer Cosmedico, UVM-7), v skladu s smernico OECD [23] . Med obsevanjem (10 min) smo plošče hranili v posodi iz stiropora, ki je vsebovala sistem za vodno hlajenje, temperaturo pa smo spremljali ves čas postopka. Na kratko, za izvedbo testa privzema NR so bile celice HaCaT zasejane (2 × 104 celic/vdolbinico) in inkubirane pri 37 °C v 5-odstotni atmosferi CO2 24 ur. Nato smo gojišče odstranili, dodali različne koncentracije testiranih snovi in ​​celice inkubirali pod enakimi pogoji 1 uro. Eno ploščo smo hranili v temi, drugo ploščo pa smo obsevali 10 minut pri temperaturi 29–32 ◦C. Nato smo celični medij zamenjali s svežim DMEM brez fenol rdečega in inkubirali 18–22 ur. Po tem inkubacijskem obdobju smo celice iz obeh plošč sprali z DPBS in v vsako vdolbinico dodali celoten DMEM, ki je vseboval 50 µg/mL NR, in inkubirali 3 ure. Po inkubaciji z NR smo raztopino NR odstranili in dodali raztopino za desorpcijo NR (50 odstotkov etanola: 1 odstotek ocetne kisline: 49 odstotkov destilirane vode), da ekstrahiramo barvilo NR iz celic. Za postopek odčitavanja smo izmerili absorbanco pri 540 nm. Znotraj vsake plošče so bile testirane kontrole DMSO. Podatki o viabilnosti celic, pridobljeni iz vsake plošče, so bili izraženi kot razmerje absorbance obdelanih celic proti kontrolnim celicam s topilom in so bili nadalje uporabljeni za oceno vrednosti IC50 z uporabo linearne regresijske analize. Vrednost foto-iritacijskega faktorja (PIF) za vsako preskusno snov je bila izračunana kot razmerje med vrednostjo IC50 obsevanih (Irr plus ) proti vrednosti IC50 neobsevanih (Irr−) celic. Po smernici OECD indeks PIF, nižji od 2, napoveduje odsotnost fototoksičnega učinka, indeks PIF med 2 in 5 napoveduje verjeten fototoksični učinek, PIF, višji od 5, pa napoveduje fototoksični učinek [23]. Testirane spojine so bile ocenjene v območju koncentracij: 12,5; 31,25; 62,5; 125; 250; 500 in 1000 µM. 3.6. Statistična analiza Vsi podatki so predstavljeni kot povprečje ± standardni odklon (SD) iz vsaj treh neodvisnih poskusov, izvedenih v treh izvodih. Za potrditev normalnosti in homogenosti variance smo uporabili D'Agostino–Pearsonov omnibusni test normalnosti, nato pa enosmerno analizo variance (ANOVA), ki ji je sledil Dunnettov post hoc test (primerjava z negativnimi kontrolnimi celicami s topilom), je bila izvedena. Grafi so bili ustvarjeni s programsko opremo GraphPadPrism za Windows (različica 6.0, GraphPad Software, Inc. (San Diego, CA, ZDA).

4. Sklepi

V tej študiji sta bila za preučevanje obnašanja naravnih fenolnih antioksidantov, izpostavljenih sevanju, ki posnema sončno svetlobo, uporabljena test reaktivnih kisikovih vrst (ROS) in test fototoksičnosti nevtralnega rdečega 3T3 (3T3 NRU-PT), da bi preučili njihovo fotoreaktivnost in fototoksičnost potencial. Dobljeni rezultati so omogočili sklep, da kljub temu, da rutin in kofeinska, p-kumarinska in ferulinska kislina absorbirajo sevanje UV-vidne svetlobe in predstavljajo MEC višje od 1000 L mol−1cm−1, so razvrščene kot nefotoreaktivne. Poleg tega te spojine niso povzročile fototoksičnosti pri testiranju s celično linijo HaCaT. Ugotovljeni podatki kažejo na toti antioksidantisami po sebi ne povzročajo fototoksičnosti, zato se lahko štejejo za varne za uporabo v kozmetičnih formulacijah. Po drugi strani pa je bilo mogoče opaziti povečanje sposobnosti preživetja celic, izpostavljenih sevanju, ko so v prisotnosti teh antioksidantov razkrili možen fotozaščitni učinek, ki bi ga lahko bilo zanimivo preučiti v podporo njihovi uporabi kot možnih fotozaščitnih sredstev v kozmetičnih formulacijah. V primeru DOPAC se je ta spojina izkazala za fotoreaktivno, čeprav v testu privzema nevtralnega rdečega 3T3 niso opazili fototoksičnosti. Vendar bi bilo treba izvesti več študij, da bi razumeli mehanizme fotoreaktivnosti DOPAC, da bi zagotovili njegovo fotoreaktivnost in tudi razumeli vlogo in razmerje med kemijsko strukturo in potencialom spojine, da je fotoreaktivna. Avtorski prispevki: Formalna analiza, BA; Pisanje – priprava izvirnega osnutka, BA; Konceptualizacija IFA, HC in JG: Viri, IFA, HC, JMSL in JG; Pisanje – pregled in urejanje, IFA, HC, JMSL in JG; Nadzor, IFA, HC in JG; Pridobitev financiranja, IFA, HC, JMSL in JG. Vsi avtorji so prebrali objavljeno različico rokopisa in se z njo strinjali. Financiranje: Ta raziskava ni prejela zunanjega financiranja. Izjava institucionalnega nadzornega odbora: Ni uporabno. Izjava o informiranem soglasju: Ni uporabno. Podatki Izjava o razpoložljivosti: Vsi podatki, predstavljeni v tej študiji, so vsebovani v članku. Zahvala: To delo je financirano z nacionalnimi sredstvi FCT-Fundação para a Ciência ea Tecnologia, IP, v okviru projekta UIDP/04378/2020, UIDB /04378/2020 ResearchUnit on Applied Molecular Biosciences-UCIBIO in projekt LA/P/0140/2020 AssociateLaboratory Institute for Health and Bioeconomy-i4HB in UIDB/00081/2020, ki ga financira FCT/MCTES (PIDDAC). Navzkrižje interesov: Avtorji izjavljajo, da ni navzkrižja interesov. Razpoložljivost vzorca: Ni primerno.

Reference

1. Zillich, OV; Schweiggert-Weisz, U.; Eisner, P.; Kerscher, M. Polifenoli kot aktivne sestavine za kozmetične izdelke. Int. J. Cosmet. Sci. 2015, 37, 455–464. [CrossRef]
2. Jelena, CH; Giorgio, R.; Justyna, G.; Neda, M.-D.; Nataša, S.; Artur, B.; Giuseppe, G. Ugodni učinki polifenolov na kronične bolezni in staranje. V Polifenoli: Lastnosti, predelava in aplikacije; Galanakis, CM, ur.; Woodhead Publishing: Kidlington, Velika Britanija, 2018; strani 69–102.
3. Cory, H.; Passarelli, S.; Szeto, J.; Tamez, M.; Mattei, J. Vloga polifenolov v zdravju ljudi in prehranskih sistemih: mini pregled. Spredaj. Nutr. 2018, 5, 87. [CrossRef]
4. Fraga, CG; Croft, KD; Kennedy, DO; Tomás-Barberán, FA Učinki polifenolov in drugih bioaktivnih snovi na zdravje ljudi. Prehranska funkcija. 2019, 10, 514–528. [CrossRef]
5. Bertelli, A.; Biagi, M.; Corsini, M.; Baini, G.; Cappellucci, G.; Miraldi, E. Polifenoli: od teorije do prakse. Foods 2021, 10, 2595. [CrossRef]
6. Chen, K.; Lu, P.; Beeraka, NM; Sukočeva, OA; Madhunapantula, SV; Liu, J.; Sinelnikov, MY; Nikolenko, VN; Bulygin, KV; Mihaleva, LM; et al. Mitohondrijske mutacije in mitoepigenetika: Osredotočite se na regulacijo odzivov, ki jih povzroča oksidativni stres, pri raku dojke. Semin. Cancer Biol. 2020. [CrossRef] [PubMed]

7. Forman, HJ; Zhang, H. Ciljanje na oksidativni stres pri bolezni: Obljube in omejitve antioksidativne terapije. Nat. Rev. Drug Discov. 2021, 20, 689. [CrossRef] [PubMed]
8. Boo, YC Ali lahko rastlinske fenolne spojine zaščitijo kožo pred trdnimi delci v zraku? Antioksidanti 2019, 8, 379. [CrossRef]
9. Jesumani, V.; Du, H.; Pei, P.; Aslam, M.; Huang, N. Primerjalna študija o aktivnosti zaščite kože ekstrakta, bogatega s polifenoli, in ekstrakta, bogatega s polisaharidi, iz Sargassum vachellianum. PLoS ONE 2020, 15, e0227308. [CrossRef] [PubMed]
10. Saraf, S.; Kaur, CD Fitokonstituente kot fotozaščitne nove kozmetične formulacije. Pharmacogn. Rev. 2010, 4, 1–11. [CrossRef]