Učinek znižanja sečne kisline in mehanizem acteozida in ehinakozida, pridobljenega iz cistante tubulosa
Mar 03, 2025
Izvleček:Cilj raziskovanja učinkov in mehanizmov acteosida (AS) in ehinakozida (ECH), ki jih izvlečemo izCistanche Tubulosa.
MetodeHyperuricemia (HUA) model podgan je bil vzpostavljen z uporabo kalijevega oksinata (1,5 g · kg -1 · d -1) v kombinaciji z adeninom (100 mg · kg -1 d -1). The HUA model rats were randomly divided into a model control group, an allopurinol group (30 mg·kg-1·d-1 ), AS low and high (50, 100 mg·kg-1·d-1 ) dose groups, and ECH low and high (50, 100 mg · kg -1 · d -1) Skupine odmerkov. Predhodno je bila ustanovljena običajna kontrolna skupina. Po štirih tednih uporabe smo uporabili analizator biokemije krvi za odkrivanje ravni sečnine SUA, krea, adenozin deaminaze (ADA) in sečne kisline (UUA) v urinu. Za odkrivanje ravni ksantine oksidaze (XOD) v serumu smo uporabili encimski imunosorbentni test. Zbrano je bilo ledvično tkivo in stehtali in izračunali koeficient ledvic. Za opazovanje ledvičnih patoloških sprememb je bil uporabljen hematoksilin eozin (He). Imunohistokemija (IHC) in PCR v realnem času sta bila uporabljena za odkrivanje ravni ekspresije beljakovin in mRNA prevodnika 1 (Urat1), transporterja glukoze 9 (GLUT9), organskega anionskega transporterja 1 (OAT1) in organskega anionskega transporterja 3 (OAT3) v ledvičnem tkivu. Rezultati AS in ECH bi lahko izboljšali delovanje ledvic pri podganah modela HUA, znižali raven sečne kisline v krvi, spodbujali izločanje sečne kisline, znižali serumsko raven ADA in XOD ter v ledvičnem tkivu uravnavali ekspresijo beljakovin in mRNA URAT1 in GLUT9 v ledvičnem tkivu.
Zaključki Feniletanoidni glikozidi AS in ECH iz Cistanche Tubulosa lahko izvajajo učinke znižanja sečne kisline z izboljšanjem delovanja ledvic pri podganah HUA, zmanjšanju ravni ADA in XOD ter uravnavanjem izražanja URAT1, GLUT9, OAT1 in OAT3.
Ključne besede: cistanche tubulosa; acteosid; ehinakozid; hiperuricemija; zmanjšanje sečne kisline; mehanizem
Ekstrakt cistanche tubulosa s 16% acteosidom
Hiperuricemija (HUA) je presnovna bolezen, ki jo povzroča neurejena presnova purina v človeškem telesu, kar vodi do povišane ravni sečne kisline v krvi [1]. Običajno se diagnosticira, ko ravni krvne sečne kisline presegajo 7. 0 mg · dl⁻¹ (416. 0 µmol·l⁻¹) pri moških in 6. 0 mg · dl⁻¹ (357. Razvoj hiperuricemije je povezan predvsem z dejavniki, kot so dieta z visoko purino, kronično uživanje alkohola, uporaba zdravil in hipotiroidizem. Ne samo poveča tveganje za srčno -žilne bolezni, diabetes in hipertenzijo [3-4], ampak tudi znatno vpliva na zdravje bolnikov.
Trenutno klinična zdravljenja hiperuricemije vključujejo predvsem zdravila, ki zavirajo proizvodnjo sečne kisline in spodbujajo izločanje sečne kisline. Vendar imajo ta zdravljenje določene omejitve za bolnike z oslabljeno funkcijo jeter ali ledvic [5-6]. Zato je raziskovanje učinkovitih zdravil z nizkimi stranskimi učinki velik pomen za preprečevanje in zdravljenje hiperuricemije.
Cistanche Tubulosa (Schenk) R. Wight, ki se običajno uporablja v tradicionalni kitajski medicini kot zelišče, ki poveljuje ledvice, se uporablja za zdravljenje stanj, kot so impotenca, neplodnost, pomanjkanje bistva in krvi, šibkost v spodnjem delu hrbta in kolena, mišična šibkost in zaprt zaradi črevesne suhosti [7]. Študije so to pokazaleCistanche TubulosaIma nevroprotektivno [8], protivnetno [9], regulacijo presnove kosti [10] in učinke, ki povečajo učinkovitost pri kemoterapiji za bolnike z rakom [11]. Med različnimi aktivnimi komponentami so najpogostejši feniletanoidni glikozidi.
Acteosid (AS) in ehinakozid (ECH), dva feniletanoidna glikozida z visoko vsebnostjo vCistanche Tubulosa, kažejo močno biološko aktivnost in imajo pomemben potencial za razvoj in uporabo. Posledično je naša raziskovalna skupina izbrala AS in ECH za nadaljnji študij. S pomočjo napovedi farmakologije in predhodi pri miših smo ugotovili, da izvleči feniletanoidni glikozid izCistanche Tubulosaima lahko določen učinek znižanja sečne kisline. Vendar poti in mehanizmi teh učinkov ostajajo nejasni.
Tako smo z uporabo mehanizmov proizvodnje sečne kisline in njegovih primarnih izločilnih poti kot raziskovalne osredotočenosti raziskovali učinke sečne kisline izvlečnih glikozidnih ekstraktov feniletanoida kot in ECH. Cilj te študije je razjasniti poti in mehanizme, skozi katere AS in ECH izvajajo učinke znižanja sečne kisline.
1 materiali
1.1 Eksperimentalne živali
Sedemdeset moških podgan SPF-Dawley (SD), ki so tehtali 150–180 g, je bilo kupljenih pri eksperimentalnem centru za živali na medicinski univerzi Xinjiang. Številka licence za proizvodnjo živali: SCXK (XIN) 2023-0001. Ta eksperiment je odobril Odbor za živalsko etiko podjetja Xinjiang avtonomno regijo Uygur Medicine Research Institute, s številko odobritve etike živali: iacuc- (zhun) -2024-009.
1.2 Zdravila in reagenti
Pheniletanoidni glikozidni izvlečki (kot in ECH)odCistanche Tubulosa (purity >98%, preverjenih z visokozmogljivo tekočinsko kromatografijo), smo ekstrahirali, očistili in pripravili s ključnim laboratorijem Uygur Science Science, Xinjiang avtonomno regijo Uygur Medicine Research Institute. Številke serije: 20220617 (AS) in 20220526 (ECH).
Allopurinol tablete, Številka serije: 62208726, izdelala Jiangsu Wanbang Biochemical Pharmaceutical Group Co., Ltd.
Kalijev oksonatinadenin, Številke: I2130050 in C2202255, kupljenih pri Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.
Crea (kreatinin), UA (sečna kislina), sečnina in ADA (adenozin deaminaza), Številke serije: 141123010, 141223004, 141323008 in 043624005, kupljenih pri Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd.
Komplet aktivnosti XOD (ksantin oksidaza), Številka serije: Y10001219, kupljena pri Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.
Protitelesa (Urat1, GLUT9, OAT1, OAT3), Številke paketov: 3i5723 0, 92F0296/4, 0F33081/2I44618, kupljeno pri Affinity Biosciences.
HRP označen s kozjimi anti-Rabbit IgG, Številka serije: 245440113, kupljeno pri ZSGB-Bio.
Raztopina obarvanja s hematoksilinom, Številka serije: 24135741H, kupljeno pri Peking Lanjieke Technology Co., Ltd.
Dab kromogeni reagentni komplet, Številka serije: 240010512, kupljena pri ZSGB-BIO.
DEPC (dietil pirokarbonat), Kataloška številka: D 60029-500 ml, kupljeno pri Amresco (ZDA).
M5 Hiclear DL2000 DNK označevalec, Kataloška številka: MF025, kupljeno pri Peking Genomics Biotechnology Co., Ltd.
Trizol ™ reagent, Kataloška številka: 15596026, kupljeno pri Thermo Fisher Scientific (ZDA).
5x All-in-One RT MastermixinEvagreen Express 2 × QPCR Mastermix-Low Rox, Kataloške številke: G492 in G891, oba kupljena pri Applied Biological Materials Inc. (ABM).
2 metode
2.1 Vzpostavitev in združevanje modela
Sedemdeset moških podgan Sprague-Dawley (SD) je bilo aklimatiziranih in razdeljenih v dve skupini: normalna kontrolna skupina (1 0 podgane) in modela kontrolna skupina (60 podgan). Običajna kontrolna skupina je bila dana 0,5% CMC-Na prek gavage. Modelno kontrolno skupino je dajal kalijev oksonat (1,5 g · kg⁻¹) v kombinaciji z adeninom (100 mg · kg⁻¹) pri odmerku 10 ml · kg⁻¹, enkrat na dan 14 zaporednih dni. Model je bil ocenjen, da je bil uspešno ugotovljen, ko se je raven sečnine, krea in SUA znatno povečala, merjena z biokemijskim analizatorjem.
The hyperuricemia model rats were further divided into the following groups based on SUA, UREA, and CREA levels: model control group, allopurinol group (30 mg·kg⁻¹), low-dose AS group (50 mg·kg⁻¹), high-dose AS group (100 mg·kg⁻¹), low-dose ECH group (50 mg·kg⁻¹), and ECH skupine z visokimi odmerki (100 mg · kg⁻¹), z 10 podganami v vsaki skupini. Za vzdrževanje stabilne hiperuricemije so bile vse skupine, razen običajne kontrolne skupine, dajali kalijev oksonat (500 mg · kg⁻¹) v kombinaciji z adeninom (100 mg · kg⁻¹) prek jutra, čemur je sledilo dajanje ustreznih zdravil v vsaki skupini popoldne. Običajna kontrolna skupina je zjutraj prejela 0,5% raztopino CMC-Na in popoldne pila vodo v odmerku 10 ml · kg⁻¹, enkrat na dan 14 zaporednih dni. Nato je bila ustavljena uporaba modeliranja, ustrezna zdravila pa so bila nenehno dajala dnevno dodatnih 14 dni.
2.2 Zbiranje vzorcev
Po končnem odmerku so podgane postili čez noč (voda ni bila omejena). Urin iz vsake skupine je bil zbran za testiranje sečne kisline. Telesna teža je bila izmerjena po postu, vzorci krvi pa so bili zbrani pod anestezijo. Serum je bil ločen s centrifugiranjem in shranjen za prihodnjo uporabo. Zbrana in stehtala so ledvična tkiva. Ena ledvica je bila pritrjena v 4% raztopini paraformaldehida, druga pa je bila za nadaljnjo analizo zamrznjena v tekočem dušiku.
2.3 Merjenje sečne kisline v urinu podgane
Vzorci urina iz vsake skupine smo centrifugirali (3, 000 r · min⁻¹, 10 min, polmer centrifuge 14 cm) in zbrali supernatant. Vzorci urina smo razredčili 1: 9 s fiziološko raztopino in analizirali na vsebnost sečne kisline z uporabo biokemičnega analizatorja.
2.4 Merjenje ADA, sečnine, Crea in Sua v serumu podgan
Vzorci krvi iz vsake skupine smo centrifugirali (3, 000 r · min⁻¹, 10 min, polmer centrifuge 14 cm) in serum zbrali. Ravni ADA, sečnine, krea in SUA v serumu so bili izmerjeni z biokemičnim analizatorjem.
2.5 Merjenje XOD v serumu podgane
Spremembe ravni XOD v serumu podgan so bile izmerjene z encimskim testom v skladu z navodili proizvajalca. Zabeležena sta bila začetna absorbanca (A₁) in končna absorbanca (A₂) pri 290 nm in izračunali ΔA (ΔA=A₂ - A₁). ΔA je bil nadomeščen v formulo:
Xod (nmol⁻¹ · min⁻¹ · ml⁻¹)=[ΔA × reakcijski sistem Skupna volumen ÷ (molski iztrebljanje koeficienta sečne kisline × Dolžina optične poti) × 10⁹] ÷ vzorčni volumen ÷ čas=4262 × ΔA,
Za izračun količine sečne kisline, katalizirane na minuto na mililiter seruma.
2.6 Merjenje koeficienta ledvic
Ledvična tkiva smo zbrali, sprali s fiziološko raztopino in odstranili odvečno vodo. Teža organa je bila natančno izmerjena, koeficient ledvic pa je bil izračunan na naslednji način:
Koeficient ledvic=teža ledvic (mg) / telesna teža (g).
2.7 Histopatološko opazovanje ledvičnega tkiva z obarvanjem
Ledvična tkiva, pritrjena v 4% raztopini paraformaldehida, smo dehidrirali z razvrščenimi koncentracijami etanola, očiščeni s ksilenom, vdelani v parafin in prerezali v 4- µm rezine. Odseke smo deparafinizirali s ksilenom, hidrirali z razvrščenim etanolom, obarvani s hematoksilinom in eozinom (HE) in zaprti z nevtralnim gumi. Morfološke spremembe v ledvičnem tkivu so opazili pri svetlobnem mikroskopu, slike pa so bile zajete pri povečavi 400 ×.
2.8 Zaznavanje izražanja proteinov Urat1, GLUT9, OAT1 in OAT3 v ledvičnem tkivu z IHC
Ledvična tkiva, pritrjena v 4% raztopini paraformaldehida, smo dehidrirali z razvrščenimi koncentracijami etanola, očiščeni s ksilenom, vdelani v parafin in seksali. Izvedeni so bili za iskanje antigena in blokiranje kozjega seruma. Primarna protitelesa (Urat1, GLUT9, OAT1, OAT3) smo dodali pri razredčitvi 1: 200 in inkubirali čez noč pri 4 stopinji. Naslednji dan smo odseke sprali s PBS, sušili na zraku in 30 minut inkubirali z biotinom, označenim s kozjim anti-rabbit IgG pri 37 stopinjah. Odseke smo oprali s PBS in 10 minut inkubirali z DAB kromogenim reagentom, nato pa 3 minute izpirali PBS, obarvanje s hematoksilinom, diferenciacijo z raztopino etanola klorovodikove, litijeve karabone, dehidracijo z nevtralnim GUM.
Za vsako podgano sta bila izbrana dva naključna 4 0 0 × polja ledvičnih odsekov. Analizirali smo pozitivno obarvanje (rjavo-rumeno) in za statistično analizo izmerili integrirano optično gostoto (IOD) vsakega polja z uporabo Image-Pro Plus 6.0.
