Urinarni eksosomi identificirajo vnetne poti pri akutni poškodbi ledvic, povezani z vankomicinom

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Linda Awdishu 1,*, Amy Le 1, Jordan Amato 1, Vidhyut Jani 1, Soma Bal 2, Robert H. Mills 1, Marvic Carrillo-Terrazas 1, David J. Gonzalez 1, Ashita Tolwani 3, Anjali Acharya 4, Jorge Cerda 5, Melanie S. Joy 6,7, Paola Nicoletti 8, Etienne Macedo 2, Sucheta Vaingankar 2, Ravindra Mehta 2, Satish P. Ramachandra Rao 9 in v imenu neposrednih preiskovalcev †

1 Skaggs School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, University of California, San Diego, CA 92093, ZDA;a6le@ucsd.edu (AL); jegilmor@ucsd.edu (JA); vgjani@ucsd.edu (VJ); rhmills@health.ucsd.edu (RHM);mac215@health.ucsd.edu (MC-T.); djgonzalez@ucsd.edu (DJG)

2 Medicinska fakulteta Univerze v Kaliforniji, San Diego, CA 92093, ZDA; sobal@ucsd.edu (SB);emacedo@ucsd.edu (EM); svaingankar@health.ucsd.edu (SV); rmehta@ucsd.edu (RM)

3 School of Medicine, University of Alabama, Birmingham, AL 35233, USA; atolwani@uab.edu

4 Albert Einstein College of Medicine, The Bronx, NY 10461, USA; anjali2526@gmail.com

5 Albany Medical College, Albany, NY 12208, ZDA; jorge.cerda82@gmail.com

6 Oddelek za ledvične bolezni in hipertenzijo, Skaggs School of Pharmacy and Pharmaceutical, Aurora, CO 80045, ZDA; MELANIE.JOY@cuanschutz.edu

7 Medicinska fakulteta Univerze v Koloradu, Aurora, CO 80045, ZDA

8 Medicinska šola Mount Sinai, New York, NY 10029, ZDA; paola.nicoletti@mssm.edu

9 Oddelek za celično in molekularno medicino Medicinskega sistema Univerze v Michiganu, Ann Arbor, MI 48109, ZDA; satishpr@med.umich.edu

* Korespondenca: lawdishu@ucsd.edu; Tel.: plus 858-534-3919

† Članstvo v neposrednih preiskovalcih je navedeno v zahvalah.

Povzetek:

Ozadje:Vankomicin se običajno uporablja kot terapija prve izbire za gram-pozitivne organizme, kot je na meticilin odporni Staphylococcus aureus. Z vankomicinom povzročena akutnaledvicapoškodba(V-AKI) so poročali pri do 43 odstotkih bolnikov, zlasti pri tistih z višjimi ciljnimi najnižjimi koncentracijami. Natančen mehanizem poškodbe pri ljudeh ostaja nedosegljiv, z nedavnimi dokazi, usmerjenimi proti apoptozi proksimalnih tubulnih celic. V tej študiji smo raziskali vsebnost beljakovin v eksosomih urina pri bolnikih z V-AKI, da bi dodatno razjasnili biomarkerje mehanizmov poškodb in možnih odzivov. Metode: V analizo so bili vključeni vzorci urina bolnikov z V-AKI, ki so bili vključeni v študijo DIRECT in so se ujemali z zdravimi kontrolami iz UAB-UCSD O'Brien CenterBiorepository. Eksosome smo ekstrahirali z uporabo principa izključitve topil in obarjanja, ki ga povzroča polietilen glikol. Identiteta in kvantifikacija beljakovin je bila določena s tekočinsko kromatografijo brez oznak z masno spektrometrijo (LC/MS). Povprečni najvišji serumski kreatinin je bil 3,7 ± 1,4 mg/dl in čas doledvicapoškodbaje bil 4.0 ± 3.0 dni. Ob odpustu je 90 odstotkov bolnikov pokazalo delno okrevanje; 33 odstotkov je doživelo popolno okrevanje do 28. dne. Proteomske analize na petih V-AKI in 7 kontrolnih vzorcih so pokazale 2009 beljakovin v vseh vzorcih in 251 proteinov, pomembno povezanih z V-AKI (Pi-rezultat > 1). Najpogostejši diskriminatorni proteini so bili komplement C3, komplement C4, galektin-3-vezavni protein, fibrinogen, alfa-2 makroglobulin, imunoglobulin težke konstante mu in serotransferin.

Zaključek:Eksosomi v urinu razkrivajo povečano regulacijo vnetnih proteinov po nefrotoksični poškodbi pri V-AKI. Za potrditev teh ugotovitev so potrebne nadaljnje študije za velik vzorec pacientov za razjasnitev patofizioloških mehanizmov in validacijo potencialnih biomarkerjev poškodb.

Ključne besede:vankomicin; AKI; nefrotoksičnost; eksosomi; vnetje; dopolniti; imunske poti

Cistanche herbalahko zdravi poškodbo ledvic

Chengdu Wecistanche imacistancheizdelki za zdravljenje poškodb ledvic

1. Uvod

Vankomicin je glikopeptidni antibiotik, ki se uporablja za zdravljenje na meticilin odpornih okužb s Staphylococcus aureus pri kritično bolnih bolnikih. Nefrotoksičnost je resen neželeni dogodek, ki prizadene 10–20 odstotkov zdravljenih bolnikov in je povezan s podaljšanim časom bivanja v bolnišnici, 30-dnevnimi stopnjami ponovnega sprejema v bolnišnico in 30-dnevno umrljivostjo zaradi vseh vzrokov [1]. Z vankomicinom povezana akutnaledvicapoškodba(V-AKI) je odvisno od odmerka in z začetkom zdravljenja po 4–17 dneh. Čeprav je V-AKI že dolgo priznan kot glavni stranski učinek vankomicina, mehanizmi nefrotoksičnosti ostajajo slabo razumljeni. Razumevanje celičnih in molekularnih odzivov, ki jih sproži vankomicin, je ključnega pomena za razumevanje mehanizmov in razvoj strategij za zmanjšanje tveganja V AKI in s tem povezanih stroškov, hkrati pa povečati njegovo učinkovitost pri zdravljenju okužb. Zdi se, da je toksični ledvični odziv posledica neposrednega učinka vankomicina na epitelij proksimalnih tubulov [2]. Do danes so bili uporabljeni standardni toksiogenomski pristopi za preučevanje V-AKI na modelih miši, vendar študije na ljudeh manjkajo [3–5]. Živalski modeli kažejo, da dajanje vankomicina povzroči oksidativni stres, ki lahko prispeva k poškodbi ledvic [6,7]. Eden od možnih mehanizmov poškodbe je ujetost zdravila v proksimalne tubulne celice, saj ga transporterji organskih kationov (OCT) prenašajo preko bazolateralne membrane v proksimalne tubulne celice, vendar niso bili ugotovljeni nobeni aktivni transportni mehanizmi iztoka [6]. –8].

Eksosomi so iz membrane pridobljeni mikrocitni vezikli, ki igrajo ključno vlogo pri medcelični komunikaciji in dostavi beljakovin/nukleinske kisline ter omogočajo odkrivanje novih biomarkerjev za pomoč pri klinični diagnoziledvicapoškodba[9]. Predlagano je bilo, da imajo eksosomi večjo specifičnost in občutljivost za odkrivanje biomarkerjev, kar pripisujejo stabilnosti vzorcev v primerjavi s transkriptomskimi in proteomskimi pristopi z uporabo običajnih vzorcev seruma in urina [9]. V tej študiji smo testirali hipotezo, da sprememba beljakovin eksosomov v urinu kot odziv na V-AKI pomaga razjasniti mehanizme poškodbe in prepoznati nove biomarkerje med bolniki s potrjeno poškodbo ledvic, povzročeno z zdravili. Za to smo uporabili preiskovance iz študije Konzorcija ledvične poškodbe, povzročene z zdravili (DIRECT), ki je mednarodna večcentrična skupina klinično presojenih primerov akutnegaledvicapoškodbain populacijski nadzor za preučevanje farmakogenomskih napovednikov z uporabo povezave na celotnem genomu. Podrobnosti študije DIRECT so opisane v razdelku Metode in nedavni publikaciji našega laboratorija [10].

2. Rezultati

V analize so bili vključeni vzorci urina 22 oseb, 10 primerov V-AKI in 12 kontrol. Demografski podatki bolnikov so bili podobni med primeri V-AKI in kontrolnimi skupinami ter so povzeti v tabeli 1. Kot je bilo pričakovano, je bila razširjenost hipertenzije, sladkorne bolezni in srčnega popuščanja večja v primerih V-AKI v primerjavi s kontrolnimi skupinami (tabela 1).

Vsi primeri V-AKI so razvili AKI stopnje 2 ali višje, kot je opredeljeno v merilih za izboljšanje globalnih rezultatov bolezni ledvic (KDIGO) (slika 1) [11]. V-AKI se je pojavil 4.0 ± 3.0 dni po uvedbi vankomicina. Časovni potek sprememb serumskega kreatinina (Scr) po sprejemu v bolnišnico do odpusta iz bolnišnice in po tem je prikazan na sliki 1.

Slika 1. Spremembe serumskega kreatinina med potekom V-AKI. Ta slika prikazuje spremembe serumskega kreatinina v 10 primerih med potekom akutnega, povezanega z vankomicinomledvicapoškodbaod sprejema v bolnišnico do 90. dne po poškodbi. Časovne točke ustrezajo časovnim točkam študije Konzorcija za ledvično poškodbo, povzročeno z zdravili (DIRECT). Okrajšave: SCr=serumski kreatinin, bolnišnica=sprejem v bolnišnico, predzdravilo=pred izpostavljenostjo zdravilu, DIRI=izpolnjena definicija ledvične poškodbe, povzročene z zdravilom, DrugDC {{8} } prekinitev zdravljenja ali zmanjšanje odmerka, Nadir Scr=najnižji serum po V-AKI, Hospital Disch= odpust iz bolnišnice

Osnovni dejavniki tveganja pri primerih V-AKI so vključevali sepso (30 odstotkov), bolezni srca (30 odstotkov), sladkorno bolezen (30 odstotkov), anemijo (20 odstotkov), izpostavljenost radiokontrastu (10 odstotkov), bolezen jeter (10 odstotkov) in hipoalbuminemija (10 odstotkov) (slika 2).

Večinoma so primeri V-AKI prejeli epizode odmerjanja treh zdravil vankomicina. Dnevni odmerki vankomicina so bili od 1000 do 4000 mg. Povprečno (interkvartilni razpon (IQR)) število dni, preživetih v vsaki epizodi odmerjanja, je prikazano na sliki 3. Povprečne (standardni odklon (SD)) najnižje koncentracije vankomicina v plazmi, povezane z epizodami odmerjanja 1–3, so bile povišane pri 20,6 ± 8,1, 29,6 ± 16,3 oziroma 38,0 ± 13 mg/L. Vendar pa razlika v koncentracijah med posameznimi epizodami ni bila statistično značilna (epizoda 1 proti 2 p=0.5, epizoda 2 proti 3 p=0.41)

Drugi podatki o rezultatih so povzeti v tabeli 2. Glede na resnost poškodbe je 20 odstotkov bolnikov potrebovalo nadomestno ledvično zdravljenje. Umrljivost v bolnišnici je bila 10 odstotkov. Ob odpustu iz bolnišnice 90 odstotkov bolnikov ni okrevalo od V-AKI. Šestim bolnikom je bil Scr izmerjen 28. dan po poškodbi in štirim 90. dan. Do 28. dne sta dva od šestih (33 odstotkov) bolnikov imela AKD, vendar nobeden od štirih preostalih bolnikov ni imel AKD do 90. dne.Ledvicabiopsije so bile izvedene v 20 odstotkih primerov V-AKI (tabela 2).

12 vzorcev, ki so bili kvalificirani za analize po namestitvi filtra za ujemanje peptidov z njihovimi sorodnimi spektri, je vsebovalo skupno 2009 proteinov. Te proteine ​​smo analizirali naprej. Najprej je bila izvedena analiza glavnih koordinat (PCoA) za primerjavo celotnega proteoma vsakega vzorca. Ta analiza je pokazala pomembno ločitev (PERMANOVA p-vrednost=0.037) med AKI in kontrolnimi vzorci (slika 4), pri čemer je povzetek fenotipa na sistemski ravni tudi na ravni eksosomskega proteina, s čimer se je povečalo naše zaupanje v te nize podatkov . Moč povezave med vsakim proteinom in statusom V-AKI je bila razvrščena z metriko pi-vrednosti, ki združuje pomembnost p-vrednosti in kratno spremembo [12].

Slika 4. Sestava proteoma razlikuje urinske eksosome bolnikov z V-AKI in kontrolnih oseb. (A) Analiza glavnih koordinat vzorčnih proteomov. Bray-Curtisova metrika razdalje je bila uporabljena za izračun razlik med vzorčnim proteomom in prikazana je glavna koordinata. Med vzorci AKI (rdeče) in kontrolnimi vzorci (modri) so opazili ločitev vzdolž osi 1 in 3. (B) Boxplot, ki povzema razdaljo Bray-Curtis med kontrolnimi vzorci in vzorci AKI. Statistična ločitev med AKI in kontrolnimi vzorci, prikazanimi v (A), je bila testirana s permutacijsko analizo variance (PERMANOVA). Prikazani so okvirji, ki povzemajo rezultate pri primerjavi razdalj kontrolnih vzorcev ali vzorcev AKI s kontrolnimi vzorci.

Nato so binarne primerjave med V-AKI in kontrolnimi vzorci dale 42 proteinov, ki so bili pomembno povezani s fenotipom AKI, in 26 proteinov, povezanih s kontrolnim fenotipom (rezultat Pi > 1) (dodatna tabela S1). Graf vulkana, ki prikazuje pomen in spremembo gube, povezano z vsakim proteinom, je prikazan na sliki 5A. Najbolj diskriminatorni proteini za primere V-AKI so bili fibrinogen, komplement C3, komplement C4, galektin-3-vezni protein, alfa-2 makroglobulin, imunoglobulin težke konstante mu in serotransferin (slika 5B). Analiza obogatitve genskega niza je bila izvedena med pomembnimi beljakovinami, da bi identificirali kategorije beljakovin, spremenjenih pri bolnikih z V-AKI, rezultati pa so povzeti v dodatni tabeli S1. Pokazalo se je, da ima več proteinov, ki so bili povezani s fenotipom AKI, funkcije, povezane z vnetjem in/ali posredovanjem vnetnega fenotipa. Da bi preverili, ali so te spremembe beljakovin morda povezane s spremembami v osnovnem signaliziranju citokinov, je bil izveden sklep o citokinih, ki je pokazal močno povezavo med proteini, povezanimi z AKI, in citokini IL10, IL6 in TNF. Ti citokini so vsebovali 2,8, 2,3 in 21-krat več povezav z beljakovinami, povezanimi z AKI, kot s proteini, povezanimi s kontrolo, kot je povzeto na sliki 5C. Mreže interakcij protein-protein proteinov, povezanih z AKI, in domnevnih citokinov so pokazale pretežno provnetne povezave med proteini, povezanimi z AKI, kot je povzeto na sliki 5D.

Slika 5. Povezave na ravni beljakovin z V-AKI. (A) Graf vulkana, ki prikazuje pomembnost spremembe gube in t-testa vsakega proteina za status V-AKI. Prvih 10 beljakovin, povezanih z AKI in kontrolnim statusom, je prikazanih v modri oziroma rdeči barvi. Drugi povezani proteini na podlagi ocene Pi > 1 so prikazani rumeno. (B) Za vsak protein je bil izračunan rezultat Pi, ki upošteva tako spremembo gube kot pomembnost t-testa, proteini z najmočnejšimi povezavami pa so narisani. (C) Topcitokini, povezani z AKI ali kontrolnimi proteini. Uporabljen je bil mrežni pristop sklepanja o citokinih in prikazani so citokini, ki kažejo najmočnejše rezultate obogatitve bodisi proti AKI bodisi proti proteinom, povezanim s kontrolo. Rdeče črte predstavljajo citokine, povezane z beljakovinami, povezanimi z AKI, modre črte predstavljajo citokine, povezane z beljakovinami, povezanimi s kontrolo. (D) Mreža interakcij protein-protein proteinov, povezanih z AKI, in ugotovljenih citokinov, obogatenih z AKI. Zunanji rob proteinskih vozlov je obarvan glede na povezave s pro- ali protivnetnimi citokini. Velikost vsakega vozlišča predstavlja moč statistične povezave vsakega proteina s statusom AKI.

Cistanche tubulosalahko zdravi poškodbo ledvic

3. Razprava

Poročamo o novem pristopu za uporabo urinskih eksosomov za obveščanje o patofizioloških mehanizmih, ki sodelujejo priledvicapoškodbaz uporabo vankomicina kot prototipa toksikanta za ledvice. Ena od prednosti te študije je vključitev dobro opredeljenih podatkov na ravni bolnika iz študije DIRECT [10], ki je bila razvita za pojasnitev mehanizmov, vključno z genomiko z zdravili povzročenihledvicapoškodba. Osebe z AKI stopnje 2 ali višje so bile na začetku izpostavljene običajnim dejavnikom tveganja. Vsi preiskovanci so imeli znatno povišane najnižje koncentracije vankomicina v plazmi, čeprav so prejemali dnevne odmerke, manjše od splošno sprejetega praga nefrotoksičnosti 4 g na dan [13]. Številni preiskovanci si ob odpustu iz bolnišnice niso popolnoma opomogli od V-AKI in so imeli mesec dni po poškodbi akutno ledvično bolezen. Kot je bilo pričakovano, je malo bolnikov prejelo biopsijo ledvic.

Proteomika urinskega eksosoma/zunajceličnih veziklov (EV) je pokazala, da ciljni diskriminatorni proteini za primere V-AKI vključujejo komplement C3, komplement C4, beljakovino, ki veže galektin-3-, fibrinogen, alfa-2 makroglobulin, imunoglobulin, težka konstanta mu in serotransferin. Te eksosomske ugotovitve obveščajo o mehanizmih poškodbe na podcelični/nadmolekularni ravni za V-AKI in potencialno služijo kot biomarkerji vzdolž kontinuuma z zdravili povzročenega bolezni.

Eksosomi, prisotni v krvi in ​​urinu, imajo pomembno vlogo pri medcelični komunikaciji, koagulaciji in ravnanju z odpadki [14]. Po s toksini povezani akutniledvicapoškodba, lahko eksosomi, sproščeni iz tubularnih epitelijskih celic, sporočajo signale poškodbe, da pridobijo infiltracijo makrofagov in spodbujajo tubulointersticijsko vnetje [15]. Ugotovili smo, da bi se vsebnost beljakovin v eksosomih razlikovala med primeri V-AKI in zdravimi kontrolami. Dvesto enainpetdeset proteinov je bilo nereguliranih pri V-AKI in zdi se, da so ti pretežno vključeni v vnetne in koagulacijske poti. Med temi 251 proteini je naša analiza pokazala, da so bili komplement C3, komplement C4, protein, ki veže galektin-3-, fibrinogen, alfa-2 makroglobulin, imunoglobulin s težkim konstantnim mu in serotransferin, pomembno povezani s primeri V-AKI.

Na podlagi naših rezultatov, da sta bila C3 in C4 med najbolj diskriminatornimi eksosomskimi proteini V-AKI, predlagamo, da je aktivacija sistema komplementa vključena v poškodbo ledvičnih tubulov, ki jo povzroči vankomicin. To se tudi dobro ujema z objavljeno literaturo, da ima aktivacija sistema komplementa vlogo pri glomerulonefritisu imunskega kompleksa in raznolikem naboru ledvičnih bolezni [16]. Poškodba ledvic zaradi aktivacije komplementa pri AKI zaradi ishemije ali izpostavljenosti nefrotoksinu je bila povezana s sistemskimi vnetnimi dogodki, ki sprožijo in prispevajo k poškodbam oddaljenih organov in smrtnosti bolnikov [17]. V modelih poškodb zaradi ishemije in reperfuzije (IR) hipoksija, izčrpavanje ATP in poškodbe mitohondrijev povzročijo nastanek prostih kisikovih radikalov po reperfuziji [18]. Citokini, kemokini in aktivacija komplementa okrepijo vnetje, kar vodi do akutne tubularne poškodbe. Poleg tega so miši s pomanjkanjem receptorjev C3a in C5a zaščitene pred poškodbami IR [19, 20]. Dokazano je, da poškodba IR poveča lokalno proizvodnjo komponent komplementa zledvicaendotelijskih in tubularnih celic [16,21]. Več študij na živalskih modelih in ljudeh je odkrilo povečano odlaganje beljakovinskih produktov komplementa, kot sta C3 in C4, vzdolž tubularne bazalne membrane po travmi ali poškodbi vledvica. Ugotovljeno je bilo, da te povečane ravni usedlin niso znatno prisotne v peritubularnem ali glomerulnem območju, ampak so močno koncentrirane v tubularni membrani, kot je razvidno iz biopsij človeških in živalskih modelov ledvic [17]. Eksosomi in EV lahko prenašajo komponente komplementa v krvnem obtoku, ko je aktivacija komplementa neregulirana [22, 23]. Več celičnih poskusov in kliničnih opazovanj je potrdilo, da sproščeni EV prenašajo in modulirajo proteine ​​komplementa, hkrati pa lahko njihova proizvodnja v vnetnem stanju vpliva tudi na število obtočnih veziklov [23]. Ta medsebojna odvisnost obeh procesov vodi do zaključka, da EV izkazujejo potencial, da so viri biomarkerjev, tarče in terapevtska sredstva za dostavo komplementa in imunomodulatornih spojin, ki so zelo pomembne v obsegu vnetnih mehanizmov AKI. Naša ugotovitev, da vzorci V-AKI v primerjavi z zdravimi kontrolami, prikazuje vlogo imunskih odzivov na neposredno toksičnost vankomicina v celicah ledvičnih tubulov. Poleg vse zgoraj navedene vsebnosti beljakovin eksosomi/EV, pridobljeni iz urina, predstavljajo tudi potencialne neinvazivne biomarkerje kot alternativo biopsiji ledvic za odkrivanje in obveščanje o vlogi sistema komplementa pri z zdravili povzročenihledvicapoškodba.

Čeprav so se številne prejšnje študije (za posebne reference glejte naslednjih nekaj stavkov) osredotočale na vlogo galektina-3 (Gal-3) priledvicapoškodba, je malo podatkov o proteinu, ki veže galektin-3 (Gal-3-bp). Gal-3 se izraža v zbiralnih tubulih ledvic in deluje tako, da spodbuja nefrogenezo, modulira interakcije celica-celica in celica-matriks ter uravnava vnetje [24–26]. Henderson et al. pregledal vlogo Gal-3 pri vnetju in ugotovil, da je Gal-3 ključna sestavina pri kroničnem vnetju in če se poškodba tkiva ponavlja. Olajša "izolacijo" poškodbe tkiva, kar upočasni širjenje poškodbe [27]. Poleg tega Nishiyama et al. je pri podganah z ishemično AKI dokazal, da je mRNA Gal-3 regulirana navzgor, naslednja reperfuzija pa je imunohistokemija pokazala povečan Gal-3 v segmentih nefrona [25]. Tsuchiyama idr. ugotovili, da je dajanje Gal-3 pri podganah z nefrotoksičnim serumskim nefritisom povzročilo zmanjšanje izločanja beljakovin z urinom, tvorbo polmeseca in zmanjšano infiltracijo makrofagov v glomerule [28]. To nakazuje, da ima po ishemični ali imunsko posredovani poškodbi Gal-3 vlogo pri regeneraciji. Kot sorodni partner Gal-3 bi bila temeljna vloga Gal-3-bp in razlog za njegovo povečano regulacijo pri nefrotoksičnih poškodbah zaradi vankomicina in drugih učinkovin nujna pozornost v prihodnjih preiskavah.

Naša študija je tudi ugotovila, da so vse tri podenote fibrinogena neregulirane, kar se dobro ujema s predhodno objavljenimi podatki. Fibrinogen je topna dimerna plazemska molekula in vsak dimer je sestavljen iz treh polipeptidov: alfa, beta in gama [29]. Ima ključno vlogo pri hemostazi in koagulaciji, vendar se je izkazalo tudi za pomembno pri uravnavanju vnetnih stanj [30–32]. Ajay et al. je pokazalo, da je razpoložljivost fibrinogena pomembna za delovanje ledvic, vnetje in preživetje [33]. Poleg tega ima lahko fibrinogen antiadhezivni učinek na epitelne celice ledvic, kar je lahko koristno, saj pomaga preprečevati tubulno obstrukcijo [34]. Fibrinogen je pri AKI znatno povečan in reguliran navzgor in je bil predhodno ocenjen kot potencialni biomarker za zgodnje odkrivanje AKI [29]. Hoffman et al., so proučevali spremembo fibrinogena po ishemiji/reperfuziji in dajanju cisplatina pri podganah, in mRNA je bila regulirana navzgor 30 minut po dvostranski poškodbi IR in je dosegla vrh pri 48–72 urah, medtem ko je bila pri dajanju cisplatina ekspresija fibrinogena mRNA odkrito po 24 urah [29]. Fibrinogen v urinu so odkrili že 3 ure po ishemični reperfuzijski poškodbi in 24 ur po dajanju cisplatina, kar ustreza velikemu povečanjuledvicapoškodbamolekula 1 (KIM-1) [29].

Koristi Cistanche: lahko zdravipoškodba ledvic

V preteklosti sta bila splošno sprejeta dva različna patofiziološka mehanizma za V-AKI, akutna tubularna nekroza zaradi neposrednih toksičnih učinkov in akutni intersticijski nefritis. Proksimalni tubulni epitelij ledvic je pri akutni tubularni nekrozi podvržen izgubi celovitosti citoskeleta, nekrozi in apoptozi [35]. Nekrotične celice sproščajo molekule, ki uravnavajo prirojeni imunski sistem, povzročajo vnetje in pospešujejo tubulno poškodbo [35]. V trenutni študiji smo dokazali označevalce vnetja v EV urina bolnikov z V-AKI. Poleg tega smo ugotovili proinflamatorno razmerje med citokini IL10, IL6 in TNF ter našimi najboljšimi proteini, ki razlikujejo AKI. Ti podatki skupaj kažejo, da je patofiziologija V-AKI tubularna toksičnost z uravnavanjem vnetja v obdobju 24–72 ur po poškodbi.

Obstaja več omejitev naše študije. Majhna velikost vzorca 22 bolnikov, ki so bili moški in pretežno belci, omejuje možnost posploševanja naših ugotovitev na druge spole, rase in etnične skupine. Druga omejitev naše študije je bila, da je vzorec eksosoma urina vsakega bolnika imel različne količine skupnih beljakovin, zaradi česar je bilo merjenje specifičnih beljakovin težko, zlasti za tiste z nižjimi absolutnimi količinami. Čeprav to sama po sebi ni nujno omejitev te študije, saj je sposobnost vsakega posameznika, da pakira beljakovine v svoje urinske eksosome, naravno spremenljiva, manjše količine beljakovin pri nekaterih posameznikih omejujejo našo sposobnost za nadaljnje analize in ustvarjanje smiselnih zaključkov, ki jih je mogoče posplošiti na večje populacije. Tretja omejitev je vzorec z eno samo časovno točko, ki omejuje naše razumevanje celičnih sprememb, ki se pojavljajo v različnih fazah kontinuuma AKI, npr. fazi takojšnje poškodbe, fazi popravila itd. Zaporedno vzorčenje bo izboljšalo naše razumevanje časovnega poteka vsebine eksosoma spremembe, oksidativni stres, ki ga povzroči kopičenje zdravil, in uravnavanje imunskih poti v popravilu. Trenutna študija je vključevala bolnike, kot so opredeljeni s pragovi Scr. Serumski kreatinin je nepopoln biomarker ledvične funkcije, saj zvišanje Scr pogosto zaostaja za poškodbo [36]. To omejuje občutljivost in specifičnost Scr za zgodnje odkrivanjeledvicapoškodba[36] in pojavile so se študije, ki so ugotavljaleledvicapoškodbabiomarkerji, kot nprledvica poškodbamolekule 1 (KIM1) in lipokalina, povezanega z nevtrofilno želatinazo (NGAL) za zgodnje odkrivanje nefrotoksičnosti [37,38]. Kot smo že poročali, imajo biomarkerji potencial za odkrivanje očitnih in subkliničnih ravni z zdravili povzročenihledvicapoškodba[39,40].

4. Materiali in metode

4.1. Izbira pacienta

V analizo so bili vključeni vzorci urina 10 bolnikov z V-AKI, ki so bili vključeni v študijo DIRECT [10], in 12 zdravih kontrolnih vzorcev urina iz biorepozitorija UAB-UCSD O'Brien Center. Kontrolni subjekti so bili glede na spol, raso in desetletje starosti enaki kot v študiji in niso bili izpostavljeni vankomicinu ali znanimledvicapoškodba. Študija DIRECT je mednarodna študija, ki preučuje farmakogenetske napovednike z zdravili povzročenihledvicapoškodbaz uporabo študije povezav celotnega genoma primerov in populacijskih kontrol [10]. Študijo DIRECT je odobril institucionalni raziskovalni odbor (IRB #121651) in vsi udeleženci so pred vpisom pridobili pisno informirano soglasje, ki je vključevalo uporabo shranjenih vzorcev za prihodnje analize. AKI je bil v DIRECT opredeljen kot nenadno zmanjšanje ledvične funkcije, dokazano s katerim koli od naslednjih kriterijev: (1) absolutno zvišanje serumskega kreatinina (Scr) (več ali enako 0,3 mg/dl ali večje ali enako 26,4 µmol/ L) (v 48-h časovnem oknu) od referenčne vrednosti Scr, (2) odstotek povečanja Scr za več kot ali enako 50 odstotkov (1,5-kratnik od referenčne vrednosti) v sedmih dneh, (3) zmanjšanje količine urina izhod (dokumentirana oligurija<0.5 ml/kg/h="" for="">6 h) kljub ustrezni reanimaciji s tekočino, kadar je primerno, (4) absolutno zmanjšanje Scr za več kot ali enako 0,3 mg/dL ali večje kot ali enako 26,4 µmol/L (znotraj 48- h časovno okno) od referenčnega Scr in (5) relativno zmanjšanje Scr za več kot ali enako 50 odstotkov (1,5-kratnik od referenčnega) v sedmih dneh. V študijo so vključili bolnike z AKI stopnje 2 ali višje po izpostavljenosti vankomicinu. Klinični podatki, vključno z demografskimi podatki, zdravstveno anamnezo, izvidi fizičnega pregleda, vitalnimi znaki, biokemijo krvi in ​​urina, rezultati biopsije in podatki o odmerjanju zdravil, so bili zbrani v naslednjih časovnih točkah: (1) sprejem v bolnišnico, (2) uvedba vankomicina, ( 3) vrh poškodbe, (4) prekinitev zdravljenja ali zmanjšanje odmerka, (5) rešitev poškodbe, (6) odpust iz bolnišnice, (7) 28 dni in (8) 90 dni po poškodbi. Epizoda odmerjanja vankomicina je bila opredeljena kot sprememba odmerka ali pogostnosti. Akutna ledvična bolezen (AKB) je opredeljena kot vztrajnost AKI stopnje 1 ali več, več kot ali enako 7 dni po izpostavljenosti [41]. Bolniki so bili ob odpustu iz bolnišnice kategorizirani z AKD, če je AKI stopnje 1 ali višje vztrajal in je bil čas od izpostavljenosti do odpusta iz bolnišnice daljši od sedmih dni. Od vseh udeležencev so bili pridobljeni vzorci urina in polne krvi. O vseh primerih V-AKI sta presodila dva neodvisna nefrologa (EM, JC, RL), da bi ugotovila vzročnost. Popoln opis metod je bil že objavljen [10].

4.2. Priprava eksosomov in zbiranje proteomskih podatkov

Vzorci urina in krvi so bili zbrani pri udeležencih študije DIRECT, vzorci pa so bili zamrznjeni pri –80 ◦C pred pripravo eksosoma. Vzorci urina, uporabljeni v tej analizi, so bili izbrani iz časovnega obdobja, ki je bilo najbližje poškodbi ledvic, in sicer od 24 do 72 ur poledvicapoškodba. Eksosome smo ekstrahirali iz zamrznjenih vzorcev urina AKI z uporabo internega protokola, razvitega na podlagi načela izključitve topil z uporabo obarjanja, ki ga povzroča polietilen glikol (PEG), kot je opisano v Rao et al. nedavna objava [42] strani eksosomskih proteinov je bila opravljena pred tripsinizacijo gela z uporabo NuPAGE bisTris10 % akrilamidnih gelov z 12 vdolbinicami za ločevanje 40 µL beljakovin iz eksosomov kontrolnih vzorcev urina in AKI.

Ekstrakte gela smo kombinirali s pufrom za preprečevanje proteolize, ki je vseboval 75 mM NaCl (Sigma, St. Louis, MO, ZDA), 3 odstotke natrijevega dodecil sulfata (SDS, Fischer, Arnold AFB, Tullahoma, TN, ZDA), 1 mM NaF (Sigma, St. Louis, MO, ZDA), 1 mM beta glicerofosfata (Sigma, St. Louis, MO, ZDA), 1 mM beta-glicerofosfata (Sigma, Sigma, St. Louis, MO, ZDA), 1 mM natrija ortovanadat (Sigma, St. Louis, MO, ZDA), 10 mM natrijev pirofosfat (Sigma, St. Louis, MO, ZDA), 1 mM fenilmetilsulfonil fluorid (PMSF, Sigma) in 1× Complete Mini EDTA prosta tableta inhibitorja proteaze vse v 50 mM HEPES (Sigma, St. Louis, MO, ZDA), pH 8,5. Za denaturacijo proteinov smo dodali enako količino 8 M sečnine v 50 mM HEPES, pH 8,5 in izvedli sonikacijo z uporabo dveh intervalov 10- s pri 25-odstotni amplitudi. Proteini so bili reducirani, alkilirani in ugasnjeni z ditiotreitolom in jodoacetamidom, kot je opisano prej [43]. Beljakovine smo oborili z dodajanjem trikloroocetne kisline (Sigma, St. Louis, MO, ZDA) vzorcem na ledu in peletiranjem beljakovin s centrifugiranjem pri 4 ◦C. Proteinske pelete smo dvakrat sprali z ledeno mrzlim acetonom. Proteinske pelete smo sušili pri 56 ◦C 30 minut, nato resuspendirali v 1 M sečnini v 50 mM HEPES in jih čez noč razgradili pri sobni temperaturi s 6 µg LysC (Wako, Richmond, Commonwealth of Virginia, ZDA), čemur je sledil {{27} }h razgradnja s tripsinom stopnje zaporedja (Promega, Fitchburg, WI, ZDA) pri 37 ◦C. Vzorce smo razsolili s C18 Sep-Paks in kvantificirali beljakovine [44]. Skupno 1,0 ug beljakovin na vzorec smo analizirali s tandemsko masno spektrometrijo s tekočinsko kromatografijo (LC-MS [2]) z uporabo 85-minutnega gradienta tekočinske kromatografije na Easy-nLC 1000 (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, ZDA) povezan na linijo z masnim spektrometrom Orbitrap Fusion (Thermo Fischer Scientific).

Kromatografijo smo izvedli na domači vlečeni in polni 30 cm koloni, ki je bila trojno polnjena s 0.5 cm, 0.5 cm in 30 cm 5 µm C4, 3 µm C18 oziroma 1,8 µm C18 in segreto na 60 ◦C. Peptide smo najprej naložili pri 500 barih, čemur je sledil kromatografski gradient v razponu od 6 do 25 odstotkov acetonitrila v 70 minutah, čemur je sledil 5-min gradient do 100 odstotkov acetonitrila, ki je bil zadržan 10 minut. Ionizacija z elektrosprejem je bila izvedena z uporabo 2000 V skozi T-spoj iz nerjavečega jekla, ki povezuje analitično kolono in sistem Easy-nLC. Vsakemu vzorcu sta sledili dve pranji, ki sta se začeli z gradientom od 3 do 100 odstotkov acetonitrila v 15 minutah z dodatnimi 10 minutami pri 100 odstotkih acetonitrila. Razpon mase do naboja (m/z) 375–1500 je bil skeniran za peptide s stanji naboja med 2–6. Za kvantifikacijo vrhov so bili uporabljeni centroidni podatki. Pridobivanje je potekalo v načinu pozitivnih ionov, ki je odvisen od podatkov. Neobdelani spektri so bili preiskani v Proteome Discoverer različici 2.1 glede na referenčno zbirko podatkov UniProt (www.uniprot.org (dostopano 5. novembra 2017)) za Homo sapiens z uporabo algoritma Sequest [18] skupaj s pristopom obratne baze podatkov, ki se uporablja za nadzor peptidov in lažnih odkritij stopnje (FDR) na 1 odstotek [17]. Prebava tripsina in silico, kot je določeno v iskalnih parametrih, poleg najmanjše dolžine peptida šestih aminokislin. Nastavitve iskanja so vključevale tudi dinamično modifikacijo za oksidacijo metioninov in statično modifikacijo karbamidometilacije cisteinov. Toleranca mase prekurzorja je bila nastavljena na 50 ppm, toleranca mase fragmenta pa 0,6 Da.

Poleg spektralnih ujemanj in beljakovin, na katere so omejeni<1% fdr,="" peptide="" matches="" were="" further="" screened="" to="" only="" include="" peptide="" spectral="" matches="" (psms)="" identified="" with="" high="" confidence.="" the="" summed="" abundance="" of="" the="" area="" under="" the="" curve="" of="" ms1="" peaks="" associated="" with="" psms="" was="" used="" to="" represent="" protein="" abundances.="" to="" help="" account="" for="" run-to-run="" variation="" in="" lc-ms2="" experiments,="" the="" raw="" protein="" abundances="" were="" next="" normalized="" by="" a="" two-step="" process.="" in="" the="" first="" step,="" protein="" abundances="" were="" divided="" by="" the="" average="" abundance="" of="" a="" given="" protein="" throughout="" the="" experiment="" divided="" by="" the="" median="" of="" the="" protein="" averages="" observed="" throughout="" the="" experiment.="" in="" the="" second="" step,="" the="" adjusted="" protein="" abundances="" were="" divided="" by="" the="" median="" protein="" abundances="" observed="" within="" their="" respective="" samples="" divided="" by="" the="" median="" protein="" abundance="" observed="" in="" the="" entire="" experiment.="" records="" of="" the="" normalization="" and="" analysis="" of="" proteomics="" data="" are="" available="" in="" a="" jupyter="" notebook="" form="" at="">

4.3. Analiza podatkov proteomike

Zapisi analize podatkov o proteomiki so bili naloženi v formatu prenosnega računalnika Jupyter v repozitorij Github (dostopan 3. marca 2021)). Analiza glavnih koordinat (PCoA) je bila izvedena z uporabo Qiime2 (različica 2019-7) [45]. Ukaz jedrne metrike časovne raznolikosti je bil uporabljen za izračun razdalj med vzorci z uporabo metrike Bray-Curtis in vizualizacijo z uporabo PCoA. Statistična analiza razdalj med kontrolnimi vzorci in vzorci V-AKI je bila izvedena z uporabo parnega testa PERMANOVA prek ukaza "qiime diversity beta-group significance". Boxplot vizualizacija teh rezultatov je bila ustvarjena s paketom seaborn (dostopano 3. marca 2021)). Binarne primerjave primerov V-AKI in kontrolnih subjektov so bile izvedene z uporabo paketa scipy ( (dostopano 3. marca 2021)) z uporabo neodvisnega t-testa z neenako varianco. Moč povezave med vsakim proteinom in statusom V-AKI je bila razvrščena z uporabo metrike pi-vrednosti, ki združuje pomembnost p-vrednosti s kratno spremembo [12]. Kot je bilo opisano prej [46], so bile pomembne povezave opredeljene kot najvišje uvrščene z vrednostjo pi > |1|. Vsaka povezava beljakovin s statusom V-AKI je bila prikazana na grafu vulkana, da bi dodatno poudarili lokacijo najvišje-10 uvrščenih beljakovin. Analiza obogatitve genskega niza je bila izvedena s pomočjo strežnika DAVID [47], pri čemer so primerjali pomembne beljakovine (pi-vrednost > |1|) z ozadjem vseh beljakovin, identificiranih v naboru podatkov. Grozdi povezanih funkcionalnih obogatitev so navedeni v dodatni tabeli S1.

To test for a relationship between V-AKI-associated proteins and inflflammatory cytokines, a recently developed network-based cytokine inference approach was utilized [48]. Briefly, a list of cytokines (TGFb, TNF, IFN, IL1-40, CXCL1-16, CCL1-27) was submitted alongside signifificantly altered proteins (pi-value > |1|) to the STRING-db tool [49]. Connections between proteins were determined using all interaction sources and a minimum interaction score >0.4. Citokini so bili najprej filtrirani, da so imeli vsaj pet povezav s precej spremenjenimi beljakovinami. Nato so primerjali delež povezav med vsakim citokinom in proteini, povezanimi z V-AKI ali s kontrolo, s skupnim številom povezav med proteini, povezanimi z V-AKI ali s kontrolo. Da bi upoštevali razlike v številu povezav, ki jih ima vsak citokin z drugimi beljakovinami, smo to vrednost nato primerjali s številom povezav, ki jih je imel vsak citokin z vsemi bistveno spremenjenimi beljakovinami. Rezultati obogatitve za izbrane citokine so bili narisani glede na njihovo povezanost z beljakovinami, povezanimi z V-AKI ali s kontrolo. Končno je bilo prečiščeno iskanje beljakovin, povezanih z V-AKI, in citokinov z obogatenimi povezavami z beljakovinami, povezanimi z V-AKI, vizualizirano za njihove interakcije z uporabo Cytoscape različice 3.5.1 [50]. Mreže interakcij protein-protein so bile okrašene z določitvijo velikosti vsakega proteina, povezanega z V-AKI, glede na njihovo povezavo pi-score s statusom V-AKI in obarvane z ugotovljeno povezavo z obogatenimi citokini s pro ali protivnetnimi učinki.

zmajeva zelišča cistanchelahko zdravipoškodba ledvic

5. Sklepi

Skušali smo bolje razumeti mehanizem poškodbe pri V-AKI iz klinično ocenjenih primerov in, zanimivo, ugotovili smo, da so komplement, galektin-3 vezavni protein in fibrinogen pomembno povezani z V-AKI. Rezultati prejšnjih študij in naši kažejo na vlogo sistema komplementa in vnetnih poti pri V-AKI. Medtem ko so potrebne večje študije za potrditev molekularnih procesov pri poškodbah, ki jih povzroči vankomicin, in posledičnih popravljalnih poti, rezultati kažejo, da lahko urinski eksosomi prispevajo pomembne informacije o patofizioloških mehanizmih in lahko služijo kot biomarkerji za z zdravili povzročenoledvicapoškodba.

Avtorski prispevki:

Konceptualizacija, LA in SPR, metodologija, SV, SPR, DJG, RM; programska oprema, DJG, RHM, formalna analiza, LA, AL, RHM; preiskava, AL, JA, VJ, SB, MC-T., PN; pisanje—priprava izvirnega osnutka, AL, JA, VJ, LA; pisanje—pregled in urejanje, RHM, DJG, MC-T., AT, AA, JC, MSJ, EM, RM, PN; nadzor, SV, SPR; projektna administracija, LA; pridobivanje sredstev, LA Vsi avtorji so prebrali objavljeno različico rokopisa in se z njo strinjali.

Financiranje:

To raziskavo je financiral Mednarodni konzorcij za resne neželene dogodke. MCT je podprl T32 Training Grant DK007202.

Izjava institucionalnega revizijskega odbora: Študija je bila izvedena v skladu s smernicami Helsinške deklaracije in jo je odobril institucionalni revizijski odbor (ali odbor za etiko) Univerze v Kaliforniji, San Diego Program za zaščito raziskav človeških subjektov (IRB#121651).

Izjava o soglasju po obveščanju: soglasje po obveščanju so pridobili vsi subjekti, vključeni v študijo

Zahvala:

Radi bi se zahvalili za prispevke preiskovalcev DIRECT: Dinna Cruz, Stuart Goldstein, Patrick Murray, Andrew Davenport, Andrew Lewington, DavidSelewski, Michael Zappitelli, Marlies Ostermann, Li Yang, Bhavna Pandya, Patrick Brophy, DanielaPonce, Julia Steinke, Josee Bouchard, Carlos Irarrazabal, David Askenazi, Nitin Kolhe, RolandoClaure-Del Granado, Nadine Benador, Clare Castledine, Jonathan Barratt, Sunil Bhandari, AlyssaRiley, Ayse Akcan-Arikan, TK Davis, Christopher Farmer, Mark Thomas, Fred Pang, Kar Hui Ng , Hansjoerg Rothe.

Nasprotja interesov:

Avtorji izjavljajo, da ni navzkrižja interesov.

Iz: 'Urinarni eksosomi identificirajo vnetne poti pri akutni ledvični poškodbi, povezani z vankomicinom' Linda Awdishu

---Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 2784