Analiza celotnega transkriptoma za raziskovanje oslabljenih imunoloških značilnosti pri kritično bolnih starejših bolnikih s sepso

Povzetek

Ozadje

Sepsa je pogost zaplet pri kritično bolnih, je zelo heterogena in povezana z visoko stopnjo obolevnosti in umrljivosti, zlasti pri starejši populaciji. Uporaba sekvenciranja RNA (RNA-Seq) za analizo bioloških poti se pogosto uporablja v kliničnih in molekularno genetskih študijah, vendar študije pri starejših bolnikih s sepso še vedno manjkajo. Zato smo raziskali biološke značilnosti in transkriptomske značilnosti, pomembne za smrtnost, pri starejših bolnikih, ki so bili zaradi sepse sprejeti na enoto intenzivne nege (ICU).

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

Metode

Vključili smo 37 starejših bolnikov s sepso z oddelka za intenzivno nego v Splošni bolnišnici veteranov Taichung. 1. in 8. dan so bili zbrani klinični in laboratorijski podatki ter vzorci krvi za analizo RNA-Seq. Identificirali smo dinamični transkriptom in obogatene poti različno izraženih genov med 8. in 1. dnem z analizo obogatitve DVID in analizo obogatitve genskega nabora. Nato smo z MiXCR analizirali raznolikost repertoarja celic T.

Rezultati

Na splošno je 37 bolnikov imelo sepso, bolniki, ki so se odzvali, in tisti, ki se niso odzvali, pa so bili razvrščeni v skupine z analizo glavnih komponent. V skupini, ki se ni odzvala, so bili ugotovljeni bistveno višji rezultati SOFA na 7. dan, daljši dnevi na ventilatorju, dolžina bivanja v oddelku intenzivne nege in umrljivost v bolnišnici kot v skupini, ki se je odzvala. Osmi dan pri starejših bolnikih na oddelku za intenzivno nego s sepso so bili geni, povezani s prirojeno imunostjo in vnetjem, kot so ZDHCC19, ALOX15, FCER1A, HDC, PRSS33 in PCSK9, povečani. Različno izraženi geni (DEG) so bili obogateni z regulacijo transkripcije, adaptivnega imunskega odziva, proizvodnje imunoglobulina, negativne regulacije transkripcije in imunskega odziva. Poleg tega je bila raznolikost receptorjev T-celic na dan -8 v skupini, ki se je odzvala, večja kot na dan -1, kar kaže, da so imeli bolje regulirano okrevanje po sepsi v primerjavi z bolniki, ki se niso odzvali .

Zaključek

Umrljivost in pojavnost sepse sta bili visoki pri starejših posameznikih. S funkcionalno potjo in analizami MiXCR, ki temeljijo na podatkih RNA-Seq, smo identificirali biološke značilnosti in transkriptomske značilnosti, pomembne za smrtnost; in ugotovili, da je imela skupina, ki se je odzvala, povečano prirojeno imunost in povečalo raznolikost T-celic; v primerjavi s skupino neodzivnih. RNA-Seq lahko ponudi dodatne dopolnilne informacije za natančno in zgodnjo napoved rezultatov zdravljenja.

rastlina cistanche krepi imunski sistem

Ključne besede

Sepsa, RNA-Seq, starejši bolnik na intenzivni negi, diferencialno izraženi geni, T-celični receptor

Uvod

Sepsa je klinični sindrom, ki je potencialno smrtno nevaren. Proizvaja ga neurejen odziv gostitelja na okužbo in je zelo heterogena in smrtonosna globalna grožnja zdravju, zlasti pri starejši populaciji [1, 2]. Prejšnje študije so pokazale, da so starejši bolniki izpostavljeni večjemu tveganju za sepso in imajo višjo resnost bolezni kot tisti v splošni populaciji [3]. Število starejših bolnikov, ki so zaradi sepse sprejeti na enoto intenzivne nege (EIT), v zadnjih dveh desetletjih vztrajno narašča zaradi nenehnega naraščanja števila starejših [4]. Predvsem kljub visoki intenzivnosti oskrbe umrljivost ostaja visoka pri starejših bolnikih, sprejetih na intenzivno nego, vendar še vedno manjkajo študije, ki bi obravnavale biološke poti, pomembne za odziv na zdravljenje pri starejših bolnikih s sepso [5]. Imunski sistem starejših je s staranjem podvržen številnim biološkim spremembam, ki vplivajo na imunski odziv starejših, kar ima za posledico večjo verjetnost imunsko oslabljenih stanj [6]. Ogrožena adaptivna imunost velja za ključno značilnost imunosenescence pri starejših [7, 8], vendar transkriptomske značilnosti med sepso pri starejših ostajajo neraziskane. Te spremembe ne določajo le dovzetnosti za bakterijske okužbe, temveč tudi napredovanje sepse in klinične izide [6]. Zato je ključnega pomena raziskati različne imunološke odzive in biološke značilnosti, pomembne za smrtnost, pri starejših bolnikih, sprejetih na intenzivno nego [9, 10].

Sepsa je zelo heterogena in zanjo so značilne kompleksne in dinamične imunološke reakcije, ki vključujejo začetni prekomerni vnetni odziv, ki mu sledi neregulirana/izčrpana adaptivna imunost [11]. Več študij je pokazalo spremenjeno adaptivno imunost po sepsi; Zdi se, da je tako imenovana imunoparaliza ena od ključnih imunoloških značilnosti, ki vodijo do vztrajno oslabljene imunosti pri bolnikih s sepso [12]. RNA-Seq je bil uporabljen v prejšnjih študijah za iskanje transkriptomskega podpisa ali "subendotipa" pri bolnikih s sepso. Subgenotipi, ki so povezani s sepso, so zgodnje izboljšanje disfunkcije organov po sepsi, oslabljena adaptivna imunost med imunsko oslabljenimi bolniki in odzivnost na steroide pri bolnikih s septičnim šokom [13, 14]. Z uporabo podatkov RNA-Seq so nedavno razvili analitična orodja, kot je MiXCR, za kvantifikacijo raznolikosti receptorjev T-celic (TCR) [15, 16]. V tej študiji smo raziskali dinamični transkriptom septičnih bolnikov s pregledovanjem parnih vzorcev od 1. in 8. dne in ugotovili, da so imeli imunsko oslabljeni septični bolniki zmanjšano raznolikost T-celic in ogroženo delovanje T-celic. Ta študija je bila namenjena raziskovanju bioloških značilnosti in transkriptomskih značilnosti, pomembnih za smrtnost, da bi pridobili boljše razumevanje signalizacije, povezane s prilagodljivo imunostjo, pri starejših bolnikih, ki so bili sprejeti na intenzivno nego zaradi sepse.

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

Kliknite tukaj za ogled izdelkov Cistanche Enhance Imunity

【Vprašajte za več】 E-pošta:cindy.xue@wecistanche.com/Whats App: 0086 18599088692/Wechat: 18599088692

Materiali in metode Načrt študije in zbiranje podatkov

Študijo je odobril institucionalni revizijski odbor TCVGH (IRB št. CE20069B), vsi udeleženci pa so pridobili informirano soglasje. Sedemintrideset starejših pacientov na oddelku za intenzivno nego je bilo izbranih iz Splošne bolnišnice za veterane Taichung (TCVGH) od decembra 2018 do januarja 2022. Ob vpisu so bili zbrani demografski podatki in 1. in 8. dan odvzeti osnovni vzorci krvi. transkriptoma sta bila dva 4 ml alikvota krvi zbrana v sterilne EDTA vacutainer posode in takoj prenesena v viale brez RNAse, ki so vsebovale 10,5 ml RNAlater® (TermoFisher, Waltham, MA, ZDA).

Ekstrakcija in sekvenciranje RNA

V tej študiji smo ekstrahirali RNA s kompletom PAXgene Blood RNA in povprečno število integritete RNA (RIN) je bilo 8,31±0,58. Pri gradnji knjižnice smo upoštevali navodila proizvajalca in v nadaljnjih poskusih uporabili 1,000 ng fragmentirane RNA. 150-bp seznanjeni odčitki so bili uporabljeni za RNA-Seq na platformi NovaSeq (Illumina, Inc., San Diego, CA, Združene države) in vsak vzorec je imel vsaj 50–60 milijonov odčitkov. Nabor podatkov RNA-seq je bil deponiran v Nacionalnem centru za biotehnološke informacije (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO) pod pristopno številko GSE216902. Nabor podatkov je bil uporabljen za celične deleže in analizo poti.

Ocena zaporedne odpovedi organa (SOFA).

Ocena zaporedne odpovedi organov (SOFA) je številčna vrednost odpovedi organov, povezane s sepso, tj. kvantificira število in resnost odpovedi organov. Vsak rezultat se giblje od 0 do 4, pri čemer višji rezultat kaže na poslabšanje disfunkcije organa [17]. Uporabili smo dinamično spremembo rezultatov SOFA za opredelitev odzivnih (R) in tistih, ki se ne odzivajo (NR), udeleženec pa je bil razvrščen kot NR, če je bilo zmanjšanje ocene SOFA od 1. do 7. dne manjše od 2 [13, 18, 19]. .

Bioinformatične analize podatkov RNA‑Seq 

Sekvenciranje je bilo visoke kakovosti, uporabljeni so bili rezultati Phred 30, HISAT2 pa je preslikal odčitke zaporedja v referenčni genom (GRCh38/hg38) [20]. Paket R DEseq2 [21] je bil uporabljen za identifikacijo različno izraženih genov (DEG), število branj pa je bilo izračunano s funkcijo FeaturesCounts [22]. Povprečna stopnja kartiranja in število odčitkov sta bila 87,6 ± 4,8 % oziroma 65,5 ± 17,6 milijona odčitkov. Paket Profiler [23] R je bil uporabljen za izvedbo funkcionalne obogatitve in analize poti na podlagi genomov (KEGG, https://www.genome.jp/kegg/) in genske ontologije (GO, http://geneontology.org). /) baze podatkov. Popravljena p-vrednost, manjša od 0,05, je veljala za znatno obogateno. Vsi diferencialno izraženi geni so bili funkcionalno označeni z analizo obogatitve genskega nabora (GSEA) [24] in ustvarjen je bil vizualiziran obogatitveni zemljevid Cytoscape 3.9.0 [25]. Rezultate GSEA smo vizualizirali z uporabo zemljevida obogatitve, ki organizira nize genov v mrežo podobnosti. Vozlišče, povezava in barva vozlišča predstavljajo nabor genov, prekrivanje članskih genov in rezultat obogatitve [24].

Raznolikost analiz TCR

Podatki RNA-Seq so bili uporabljeni v MiXCR v3.0.13 [15, 16] za kvantifikacijo klonotipov bolnikov s sepso na podlagi predhodno poročanega protokola [14]. Programska oprema VDJTools v 1.2.1 [26] je bila uporabljena za izračun števila regij, ki določajo komplementarnost-3 (CDR3), in raznolikosti vzorcev po pridobitvi kvantificiranih klonotipov.

Statistične analize

Za preverjanje normalnosti smo uporabili Kolmogorov–Smirnov test in ugotovili, da je bila porazdelitev več spremenljivk, vključno z dnevom ventilatorja, dolžino bivanja v intenzivni negi in dolžino bivanja v bolnišnici, levo poševna. Za prikaz podatkov v poenotenem formatu smo predstavili frekvence kategoričnih spremenljivk (odstotke) za kategorične spremenljivke in zvezne spremenljivke kot mediano (interkvartilni razpon, IQR). Razlike med obema skupinama smo analizirali s pomočjo Mann–Whitneyjevega U testa za zvezne spremenljivke in Fisherjevega natančnega testa za kategorične spremenljivke. Raven pomembnosti je bila nastavljena na 0.05, statistične analize pa so bile dvostranske. Za izvedbo vseh analiz podatkov je bila uporabljena različica R 4.1.0.

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

Rezultati Značilnosti pacienta in ocene SOFA

V to študijo smo vključili 37 starejših bolnikov s sepso [mediana starost 83 let (IQR: 79–87 let)] (tabela 1). Z analizo glavnih komponent smo opazili, da je bila razlika med dnevom -1 in dnevom -8 boljša pri odzivnih bolnikih (skupina odzivnih, R) kot pri neodzivnih bolnikih (skupina neodzivnih, NR), kar kaže na urejeno okrevanje po sepsi v imunsko kompetentni skupini (dodatna datoteka 1: slika S1). Na splošno je bilo med 37 bolniki 23 odzivnih bolnikov (skupina z odzivom, R) s srednjo starostjo 82 let (IQR: 79,5–86,5 let) in 14 neodzivnih bolnikov (skupina z odzivom, NR) z mediana starost 84 let (IQR: 79–88 let). Tabela 1 prikazuje osnovne značilnosti študijske skupine. Pri zdravljenju so opazili višje albumine (mediana 3,3 mg/dl, IQR: 3–3,7 mg/dl) in nižji C-reaktivni protein (mediana 9,16 mg/dl, IQR: 3,9–17,5 mg/dl) kot pri njihovih sorodnikih. V primerjavi s skupino, ki se je odzvala, je imela skupina, ki se ni odzvala, 7. dan znatno višje ocene SOFA, daljše dneve z ventilatorjem, daljše bivanje na oddelku za intenzivno nego in višjo umrljivost v bolnišnici.

Izrazit dinamični transkriptom pri starejših bolnikih na intenzivni negi s sepso

Kot je prikazano na sliki 1A, smo z uporabo analize glavnih komponent na 500 najboljših variabilnih genih iz vseh vzorcev odkrili, da so imeli starejši bolniki s sepso v enoti intenzivne nege 1. in 8. dan pomembno različne transkriptome. Geni diferencialne ekspresije ( DEG) so nato identificirali s primerjavo profilov izražanja genov med 8. in 1. dnevom pri starejših bolnikih na intenzivni negi z uporabo meril p<0.01 and log fold change>0.25 ali<− 0.25. Tree DEGs (two upregulated and one downregulated gene) were found in the R group, while the NR group only had 11 DEGs (five upregulated and six downregulated genes). We found that in elderly sepsis patients in the ICU, the top upregulated genes were innate immunity- and inflammation-relevant genes, namely, ZDHCC19, ALOX15, FCER1A, HDC, PRSS33, and PCSK9, which bind to low-density lipoprotein receptors (LDLRs), leading to LDLR degradation and increasing LDL cholesterol levels (Fig. 1B). 

DAVID analiza obogatitve dinamičnega transkriptoma

Da bi prikazali spremembo bioloških poti pri starejših bolnikih na intenzivni negi med 8. in 1. dnevom, smo prikazali obogateno pot z uporabo spletnega strežnika DAVID v6.8. Kot je prikazano na sliki 2, so bile mehurčaste ploskve genske ontologije (GO) izdelane za biološke procese 20 najboljših DEG iz nabora podatkov. Ugotovili smo, da so bili DEG pri starejših bolnikih na intenzivni negi s sepso obogateni z regulacijo transkripcije, adaptivnega imunskega odziva, proizvodnje imunoglobulina, negativne regulacije transkripcije in imunskega odziva. DAVID funkcionalna analiza GO je predstavljena na sliki 3. V primerjavi s kontrolami so funkcionalne opombe proteinov, kodiranih z geni v DEG, pokazale pomembno (P<0.05) increased or decreased enrichment. These annotations were categorized according to biological processes, cellular components, and molecular functions. There were significant differences between DEG-encoded proteins involved in the regulation of transcription, the immune response, protein phosphorylation, and Ras protein signal transduction at the level of biological processes (Fig. 3), whereas cellular component analysis revealed significant differences between the T-cell receptor complex, cytosol nucleoplasm, and nucleus (Fig. 3). Significant differences were found in the enrichment of encoded proteins associated with protein binding, metal ion binding, translation factor activity, or transcriptional activator activity according to molecular function analysis (Fig. 3). Ten, we used the Cytoscape ClueGO plugin to investigate the functional enrichment of the DEGs in the dataset to further refine the biological process from the analysis of DAVID-GO terms [27]. Additionally, the REACTOME pathway analysis from ClueGO revealed that cytokine signaling in the immune system, adaptive immune system, sensory perception, innate immune system, and immunoregulatory interactions between lymphoid and non-lymphoid cells were significantly enriched in many DEGs.

Tabela 1 Značilnosti starejših bolnikov na intenzivni negi s sepso

Slika 1 Analiza glavne komponente A in graf vulkana B transkriptoma med dnevom-1 in dnevom-8

Slika 2 Analize obogatitve funkcij in poti diferencialno izraženih genov z DAVID z mehurčastim grafom

Slika 3 Analiza funkcionalne genske ontologije DAVID (GO) biološkega procesa (BP), celične komponente (CC) in molekularne funkcije (MF)

Analize TCR z MiXCR pri starejših bolnikih na intenzivni negi s sepso

Glede na to, da sta si skupini R in NR opomogli od sepse po specifični signalni poti T-celičnega receptorja z uporabo števila edinstvenih CDR3, D50 in inverznega Simpsonovega indeksa, smo uporabili MiXCR za določitev raznolikosti T-celičnega receptorja (TCR ) (sl. 5A–C). 8. dan so bili CDR3, D50 in inverzni Simpsonov indeks skupine R bistveno višji kot 1. dan. Poleg tega je bil indeks D50 8. dan v skupini R bistveno višji kot v skupini NR (slika 5B). Končno smo ocenili raznolikost edinstvenega CDR3 z inverznim Simpsonovim indeksom, ki odraža obilo klonotipov. Opazili smo podoben vzorec z znatno povečano raznolikostjo TCR v skupini R, zlasti 8. dan (slika 5C).

Diskusija

Ta študija dokazuje, da bi biološke značilnosti, pomembne za umrljivost, in signalizacija, povezana s prilagodljivo imunostjo, z uporabo transkriptomike, s primerjavo razlik med dnevom 1 in 8 (dodatna datoteka 1: slika S1), lahko zanesljivo identificirali starejše bolnike na intenzivni negi s sepso in razlikovali neodzivne od odzivnih bolnikov . Prejšnje študije, ki so preučevale biomarkerje sepse, so bile odvisne od izbire znanih bioloških funkcij in poti z uporabo na znanju temelječih metod [28] in le majhno število študij je neposredno ciljalo na gene, katerih funkcije niso bile v celoti opisane [29]. V tej študiji smo sprejeli RNA-Seq za identifikacijo bioloških in imunoloških značilnosti pri starejših bolnikih na intenzivni negi s sepso z analizo glavnih komponent, analizo diferencialne genske ekspresije in MiXCR. Prirojena imunost in vnetje, kot so ZDHCC19, ALOX15, FCER1A, HDC, PRSS33 in PCSK9, sta bila povečana pri starejših bolnikih na intenzivni negi s sepso. ZDHHC19 je palmitoiltransferaza in posreduje palmitoilacijo RRAS, kar vodi do povečane viabilnosti celic [30]. Analiza ekspresije genov na celotnem genomu je bila povezana s povečano ekspresijo pri bolnikih na intenzivni negi s sepso, ki jo povzroča fekalni peritonitis [31]. HDC (histidin dekarboksilaza, HDC) je član družine dekarboksilaz skupine II in tvori homodimer, ki uporablja piridoksal fosfat za pretvorbo L-histidina v histamin. Študija na živalih, ki so jo izvedli Hattori et al. [32] so uporabili miši z izločitvijo gena HDC (HDC−/−). Po indukciji sepse z ligacijo in punkcijo slepega cekuma (CLP) so HDC-knockout miši pokazale znižane ravni histamina v plazmi, povečanje ravni TNF, IL-1b, IL-6 in MCP1 pri sepsi pa je bilo oslabljeno, ko je primanjkovalo plazme histamin [32]. Nenormalna proizvodnja citokinov, povzročena s sepso, in poškodbe več organov (pljuča, jetra in ledvice) so se znatno zmanjšale pri miših z izločitvijo HDC v primerjavi z mišmi WT C57BL/6 J. Inhibicija ekspresije HDC je preprečila vnetno poškodbo tkiva in izboljšala preživetje pri miših s sepso, ki jo je povzročil CLP [32]. Poleg tega bi lahko histamin spodbujal proizvodnjo vnetnih citokinov, ki jih uravnava transkripcijski faktor NF-κB. Pri sepsi, povzročeni s CLP, so imele HDC-knockout miši bistveno zmanjšano aktivnost NF-κB v jedru v primerjavi z mišmi WT [32]. Ta rezultat kaže, da histamin inducira sintezo vnetnih citokinov in kemokinov s povečanjem aktivnosti NF-kB.

Nedavne raziskave so pokazale, da sta ALOX15 in FCER1A ključna za patogenezo bakterijske sepse [33, 34]. ALOX15, encim za peroksidacijo lipidov, je funkcionalni gen za lipoksigenazo (LOX) [35], ki oksidira večkrat nenasičene maščobne kisline in je povezan z različnimi fiziološkimi procesi ter s patogenezo nevrodegenerativnih, vnetnih in hiperproliferativnih bolezni [35, 36]. ALOX15 in njegovi metaboliti so vpleteni v patofiziologijo številnih vnetnih bolezni, kot so sepsa, artritis, astma, cistična fibroza in ateroskleroza [36]. FCER1A (Fc fragment IgE receptorja Ia, FCER1A), imunsko povezan protein, je začetni dejavnik alergijskih reakcij in igra vlogo pri alergijskem vnetju [37, 38]. FCER1A je bil v prejšnjih študijah vpleten v uravnavanje presnovnih procesov in imunsko regulacijo. [38, 39]. Poleg tega obstaja večja verjetnost za pojav astme, ko FCER1B in drugi vnetni geni, povezani z imunoglobulinom, medsebojno delujejo [39]. Poleg tega je bil PCSK9 (protein konvertaza subtilizin/keksin tipa - 9, PCSK9) identificiran kot osrednji regulator ravni LDL-C v plazmi zaradi svoje sposobnosti, da se veže na receptor LDL (LDLR) in ga sproži za lizosomsko razgradnjo v celicah. , kar vodi do razgradnje LDLR in zvišanja ravni holesterola LDL [40].

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

V tej študiji smo uporabili obogatitev KEGG in GO, da bi določili funkcionalno opombo teh genov, da bi raziskali vpletenost izraženih DEG pri starejših bolnikih z intenzivno nego s sepso pri BP, MF in molekularnih poteh FH. Ti DEG so bili predvsem obogateni z regulacijo transkripcije, adaptivnega imunskega odziva, proizvodnje imunoglobulina, negativne regulacije transkripcije in imunskega odziva (slika 2). Konstruirali smo funkcionalno urejeno mrežo izrazov GO/pathway z uporabo vtičnika Cytoscape ClueGO/CluePedia, izboljšane interpretacije bioloških izrazov. Ta vtičnik nam je tudi pomagal vizualizirati mreže, ki so funkcionalno združene iz večjih genskih skupin [41]. Uporabili smo vtičnik ClueGO za identifikacijo različno reguliranih molekularnih poti in njihovih pomembnih genskih interakcij na podlagi p-vrednosti in statistike kappa, da bi pridobili celovito sliko DEG, vključenih v sepso. Poleg tega so bili DEG znatno obogateni s transkripcijsko aktivnostjo in vezavo na beljakovine, ko je bil analiziran MF iz GO (slika 3). Ti rezultati kažejo, da se analize funkcionalne obogatitve nanašajo zlasti na signalne poti imunskih celic, povezane s celičnim odzivom na patogene motive ali citokine. To so verjetno pričakovani rezultati za bolnike s sepso in potrebujejo nadaljnje preiskave za razjasnitev poti sepse. Na podlagi kappa statistike in p-vrednosti smo ugotovili, da so med obogatenimi biološkimi procesi in molekularnimi potmi signalizacija citokinov v imunskem sistemu, adaptivni imunski sistem, senzorično zaznavanje, prirojeni imunski sistem in imunoregulacijske interakcije med limfoidnimi in nelimfoidnimi celice so bile neregulirane in so bile pomembno povezane z napredovanjem sepse pri starejših bolnikih na intenzivni negi s sepso (slika 4).

Poleg tega smo pokazali raznolikost celic T pri starejših bolnikih s sepso in uporabili MiXCR za analizo neobdelanega zaporedja RNA-Seq za določitev klonotipov TCR, kar nam je omogočilo istočasno preučevanje raznolikosti TCR in celotnega transkriptoma [ 15]. V tej študiji sta bila uporabljena RNA-Seq in MiXCR za identifikacijo signalizacije celic T in rezultati so pokazali, da je bila raznolikost TCR skupine R na dan -8 večja kot na dan -1 (slika 5) . V primerjavi s skupino NR je imela skupina R znatno višje vrednosti CDR3, D50 in inverznega Simpsonovega indeksa na dan -8 kot na dan -1. Pomen povzročene raznolikosti TCR pri starejših bolnikih na oddelku za intenzivno nego s sepso je poudarjen tudi s temi dokazi, ki dokazujejo sposobnost preživetja uporabe podatkov RNA-Seq in MiXCR za obravnavanje raznolikosti TCR pri bolnikih s sepso. Naša študija ima nekaj omejitev, ki jih je treba upoštevati. Prvič, skupina bolnikov, preiskovanih v tej študiji, je bila majhna. Zato bi preiskave različnih populacij z večjim vzorcem pomagale potrditi naše podatke. Drugič, v tej študiji smo uporabili množico RNA-Seq, prihodnji sc-RNA-Seq in funkcionalni poskusi pa so upravičeni za validacijo na celični ravni. Poleg tega se lahko pristop 5' hitrega pomnoževanja koncev cDNA (5'-RACE) uporabi za raziskovanje repertoarja T-celic, kar lahko dodatno potrdi naše ugotovitve. Tretjič, ocenili smo biološke in molekularne funkcije vnetnih odzivov pri bolnikih s sepso z uporabo podatkov RNA-Seq. Za razjasnitev vloge pri sepsi so potrebne nadaljnje funkcionalne študije.

Slika 4 Obogatitev z izrazi genske ontologije (GO) je bila vizualizirana z uporabo vtičnika ClueGO/CluePedia podjetja Cytoscape

Slika 5 Raznolikost T-celičnega receptorja na dan-1 in dan-8. Število (A), edinstven CDR3 (B), D50 in (C) inverznega Simpsonovega indeksa. *<0.05, **<0.005

Sklepi

Pojavnost in umrljivost zaradi sepse sta visoki pri starejših posameznikih. Naša študija je vključila kritično bolne starejše posameznike s sepso in identificirala biološke lastnosti, pomembne za smrtnost, in transkriptomske značilnosti s funkcionalno potjo in analizami MiXCR na podlagi podatkov RNA-Seq. V primerjavi s 1. dnem smo 8. dan ugotovili povečano prirojeno imunost in povečano raznolikost celic T med odzivnimi bolniki, kar kaže, da so imeli odzivni bolniki bolje regulirano okrevanje po sepsi v primerjavi z neodzivnimi bolniki. Za izvajanje natančne in zgodnje napovedi bi uporaba testa RNA-Seq lahko ponudila dodatne dopolnilne informacije za zgodnjo napoved rezultatov zdravljenja.

Reference

1. Seymour CW, Kennedy JN, Wang S, Chang CH, Elliott CF, Xu Z, et al. Izpeljava, validacija in morebitne posledice zdravljenja novih kliničnih fenotipov za sepso. JAMA. 2019;321(20):2003–17.

2. Sweeney TE, Azad TD, Donato M, Haynes WA, Perumal TM, Henao R, et al. Nenadzorovana analiza transkriptomike pri bakterijski sepsi v več nizih podatkov razkrije tri robustne skupine. Crit Care Med. 2018; 46 (6): 915–25.

3. de Lange DW, Brinkman S, Flaatten H, Boumendil A, Morandi A, Andersen FH, et al. Kumulativni prognostični rezultat, ki napoveduje umrljivost pri bolnikih, starejših od 80 let, sprejetih na intenzivno nego. J Am Geriatr Soc. 2019; 67 (6): 1263–7.

4. Flaatten H, de Lange DW, Artigas A, Bin D, Moreno R, Christensen S, et al. Status raziskav intenzivne medicine in prihodnji program za zelo stare bolnike na oddelku za intenzivno nego. Intenzivna nega Med. 2017; 43 (9): 1319–28.

5. Guidet B, de Lange DW, Boumendil A, Leaver S, Watson X, Boulanger C, et al. Prispevek šibkosti, kognicije, dejavnosti vsakodnevnega življenja in komorbidnosti na izid pri akutno sprejetih bolnikih, starejših od 80 let, v evropskih oddelkih za intenzivno nego: študija VIP2. Intenzivna nega Med. 2020;46(1):57–69.

6. Stahl EC, Brown BN. Strategije celične terapije za boj proti znanosti o imunogenih. Organogeneza. 2015; 11 (4): 159–72.

7. Martin S, Perez A, Aldecoa C. Sepsa in imunosenescenca pri starejših bolnikih: pregled. Front Med (Lausanne). 2017. https://doi.org/10. 3389/fmed.2017.00020.

8. Rydyznski Moderbacher C, Ramirez SI, Dan JM, Grifoni A, Hastie KM, Weiskopf D, et al. Antigensko specifična adaptivna imunost na SARS-CoV-2 pri akutnem COVID-19 in povezave s starostjo in resnostjo bolezni. Celica. 2020;183(4):996-1012 e1019.

9. Leblanc G, Boumendil A, Guidet B. Deset stvari, ki jih morate vedeti o kritično bolnih starejših bolnikih. Intenzivna nega Med. 2017; 43 (2): 217–9.

10. Guidet B, Vallet H, Boddaert J, de Lange DW, Morandi A, Leblanc G, et al. Skrb za kritično bolne bolnike, starejše od 80 let: pripovedni pregled. Ann Intenzivna nega. 2018; 8 (1): 114.

11. Brady J, Horie S, Lafey JG. Vloga adaptivnega imunskega odziva pri sepsi. Intensive Care Med Exp. 2020; 8 (1): 20.

12. Martin MD, Badovinac VP, Grifth TS. Odzivi CD4 T celic in stanje imunoparalize, ki jo povzroči sepsa. Front Immunol. 2020. https://doi.org/10. 3389/fmmu.2020.01364.

13. Barcella M, Bollen Pinto B, Braga D, D'Avila F, Tagliaferri F, Cazalis MA, et al. Identifikacija profila transkriptoma, povezanega z izboljšanjem delovanja organa pri bolnikih s septičnim šokom po zgodnji podporni terapiji. Crit Care. 2018; 22 (1): 312.

14. Cheng PL, Chen HH, Jiang YH, Hsiao TH, Wang CY, Wu CL, et al. Uporaba RNA-Seq za raziskovanje značilnosti imunskega metabolizma pri imunsko oslabelih bolnikih s sepso. Front Med (Lausanne). 2021. https://doi. org/10.3389/fmed.2021.747263.

15. Bolotin DA, Poslavsky S, Mitrophanov I, Shugay M, Mamedov IZ, Putintseva EV, et al. MiXCR: programska oprema za celovito profiliranje prilagodljive imunosti. Nat metode. 2015; 12 (5): 380–1.

16. Bolotin DA, Poslavsky S, Davydov AN, Frenkel FE, Fanchi L, Zolotareva OI, et al. Profiliranje repertoarja antigenskih receptorjev iz podatkov RNA-seq. Nat Biotechnol. 2017; 35 (10): 908–11.

17. Vincent JL, de Mendonca A, Cantraine F, Moreno R, Takala J, Suter PM, et al. Uporaba ocene SOFA za oceno incidence organske disfunkcije/odpovedi v enotah intenzivne nege: rezultati multicentrične, prospektivne študije Delovna skupina za "s sepso povezane težave" Evropskega združenja za intenzivno nego. Crit Care Med. 1998; 26 (11): 1793–800.

18. Garcia-Gigorro R, Saez-de la Fuente I, Marin Mateos H, Andres-Esteban EM, Sanchez-Izquierdo JA, Montejo-Gonzalez JC. Uporabnost rezultatov SOFA in Delta-SOFA za napovedovanje izidov pri kritično bolnih bolnikih z urgentnega oddelka. Eur J Emerg Med. 2018; 25 (6): 387–93.

19. Jones AE, Trzeciak S, Kline JA. Ocena zaporedne odpovedi organov za napovedovanje izidov pri bolnikih s hudo sepso in znaki hipoperfuzije v času predstavitve urgentnega oddelka. Crit Care Med. 2009;37(5):1649–54.

20. Kim D, Langmead B, Salzberg SL. HISAT: hitro spojen aligner z nizkimi zahtevami po pomnilniku. Nat metode. 2015; 12 (4): 357–60.

21. Anders S, Huber W. Analiza diferencialnih izrazov za podatke o štetju zaporedij. Genome Biol. 2010;11(10):R106.

22. Liao Y, Smyth GK, Shi W. FeatureCounts: učinkovit splošni program za dodeljevanje odčitkov zaporedja genomskim značilnostim. Bioinformatika. 2014; 30 (7): 923–30.

23. Raudvere U, Kolberg L, Kuzmin I, Arak T, Adler P, Peterson H, et al. g: Profiler: spletni strežnik za analizo funkcionalne obogatitve in pretvorbe genskih seznamov (posodobitev 2019). Nucleic Acids Res. 2019;47(W1):W191–8.

24. Merico D, Isserlin R, Stueker O, Emili A, Bader GD. Zemljevid obogatitve: mrežna metoda za vizualizacijo in inter‑predacijo obogatitve genskega niza. PLoS ENA. 2010;5(11):e13984.

25. Shannon P, Markiel A, Ozier O, Baliga NS, Wang JT, Ramage D, et al. Cytoscape: programsko okolje za integrirane modele biomolekularnih interakcijskih mrež. Genome Res. 2003; 13 (11): 2498–504.

26. Andersen ES. Napovedovanje in načrtovanje struktur DNA in RNA. N Bio‑tehnologija. 2010; 27 (3): 184–93.

27. Le Gall JR, Lemeshow S, Saulnier F. Nova poenostavljena ocena akutne fiziologije (SAPS II), ki temelji na evropsko/severnoameriški multicentrični študiji. JAMA. 1993; 270 (24): 2957–63.

28. Sutherland A, Thomas M, Brandon RA, Brandon RB, Lipman J, Tang B, et al. Razvoj in validacija novega diagnostičnega testa molekularnih biomarkerjev za zgodnje odkrivanje sepse. Crit Care. 2011;15(3):R149.

29. Lukaszewski RA, Jones HE, Gersuk VH, Russell P, Simpson A, Brealey D, et al. Predsimptomatska diagnoza pooperativne okužbe in sepse z uporabo podpisov genske ekspresije. Intenzivna nega Med. 2022. https://doi. org/10.1007/s00134-022-06769-z.

30. Niu J, Sun Y, Chen B, Zheng B, Jarugumilli GK, Walker SR, et al. Maščobne kisline in ZDHHC19, ojačan z rakom, spodbujajo aktivacijo STAT3 prek S-palmitoilacije. Narava. 2019; 573 (7772): 139–43.

31. Burnham KL, Davenport EE, Radhakrishnan J, Humburg P, Gordon AC, Hutton P, et al. Skupni in različni vidiki transkriptomskega odziva sepse na fekalni peritonitis in pljučnico. Am J Respir Crit Care Med. 2017; 196 (3): 328–39.

32. Hattori M, Yamazaki M, Ohashi W, Tanaka S, Hattori K, Todoroki K, et al. Kritična vloga endogenega histamina pri spodbujanju poškodbe tkiva končnega organa pri sepsi. Intensive Care Med Exp. 2016; 4 (1): 36.

33. Reyes M, Filbin MR, Bhattacharyya RP, Billman K, Eisenhaure T, Hung DT, et al. Imunski celični podpis bakterijske sepse. Nat Med. 2020; 26 (3): 333–40.

34. Tang-Huau TL, Gueguen P, Goudot C, Durand M, Bohec M, Baulande S, et al. Človeške in vivo generirane dendritične celice in makrofagi, pridobljene iz monocitov, navzkrižno predstavljajo antigene po vakuolarni poti. Nat Commun. 2018; 9 (1): 2570.

35. Ivanov I, Kuhn H, Heydeck D. Strukturna in funkcionalna biologija 15-lipoksigenaze-1 arahidonske kisline (ALOX15). Gene. 2015; 573 (1): 1–32.

36. Singh NK, Rao GN. Naraščajoča vloga 12/15-lipoksigenaze (ALOX15) pri človeških patologijah. Prog Lipid Res. 2019; 73: 28–45.

37. Baioumy SA, Esawy MM, Shabana MA. Ocena kroženja FCepsilonRIa pri bolnikih s kronično spontano urtikarijo in njena korelacija s kliničnimi in imunološkimi spremenljivkami. Imunobiologija. 2018; 223 (12): 807–11.

38. Liao EC, Chang CY, Hsieh CW, Yu SJ, Yin SC, Tsai JJ. Raziskovalna pilotna študija genetskih markerjev za alergijske bolezni, ki jih povzroča IgE, z izrazi FcepsilonR1alpha in Cepsilon. Int J Mol Sci. 2015; 16 (5): 9504–19.

39. Hua L, Zuo XB, Bao YX, Liu QH, Li JY, Lv J, et al. Interakcija genov s štirimi lokusi med IL13, IL4, FCER1B in ADRB2 za astmo pri kitajskih otrocih Han. Pediatr Pulmonol. 2016; 51 (4): 364–71.

40. Kosenko T, Golder M, Leblond G, Weng W, Lagace TA. Lipoprotein nizke gostote se veže na proprotein konvertazo tipa subtilizin/keksin-9 (PCSK9) v človeški plazmi in zavira razgradnjo receptorja lipoproteina nizke gostote, ki jo posreduje PCSK9-. J Biol Chem. 2013; 288 (12): 8279–88.

41. Bindea G, Mlecnik B, Hackl H, Charoentong P, Tosolini M, Kirilovsky A, et al. ClueGO: vtičnik Cytoscape za dešifriranje funkcionalno združene genske ontologije in omrežij za označevanje poti. Bioinformatika. 2009; 25 (8): 1091–3.