Estrogena aktivnost glikozidov iz Cistanche Deserticola kot adjuvansa za estrogenske receptorje in vitro

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

Hui Song, Wen-Lan Li, Xiang-Ming Sun, Yang Hu, Jing-Xin Ding, Yu-Bin Ji, Jing-Ya Wang

UVOD

Cistanche deserticola("Rou Cong Rong" v kitajščini), tradicionalno kitajsko zeliščno zdravilo, ki je bilo prvič zabeleženo v ShenNongBenCaoJingu, se že tisočletja uporablja za zdravljenje pomanjkanja ledvic, impotence, senilnega zaprtja in pomanjkanja krvi.[1] Razširjen je predvsem v puščavskih regijah severozahodne Kitajske, kot sta Gansu in Xinjiang.[2] Sodobne farmakološke raziskave so pokazale, da lahko C. deserticola izboljša široke medicinske funkcije, kot so regulacija hormonov, imunomodulatorna, antioksidativna, nevroprotektivna, protivnetna in estrogenska aktivnost. [3,4] Glikozidi Cistanches (GC) so veljali za enega od glavne učinkovine z različnimi biološkimi učinki.[5,6]

Estrogenski receptorji‑ (ERs‑ ) in ER so podvrste ER, ki lahko uravnavajo fiziološke funkcije.[7] Ti proteini bi lahko regulirali transkripcijo ciljnih genov z vezavo na povezana DNA regulatorna zaporedja v celičnem jedru. Oba podtipa sta izrazito izražena v kardiovaskularnem in centralnem živčnem sistemu [8,9] ER obstaja predvsem v mlečni žlezi, maternici, jajčnikih, kosteh, moških reproduktivnih organih in prostati. ER je prisoten predvsem v prostati, jajčnikih in mehurju. [10, 11] Poleg tega obstaja nekaj skupnih fizioloških vlog obeh podtipov, na primer pri razvoju in delovanju jajčnikov ter pri zaščiti srčno-žilnega sistema. [12,13] Prejšnje raziskave v naši skupini so z metodo metabolomične analize razkrile estrogenom podoben mehanizem GC.[14] V kontinuirani študiji smo analizirali mehanizem estrogene aktivnosti GC na celičnih linijah MCF-7, povezanih z ER.

MATERIALI IN METODE

instrumenti

Inkubator ECO‑170P‑230 je bil od New Brunswick Scientific (China) Co., Ltd., čitalnik mikroplošč Bio‑Rad 680, aparat za elektroforezo pa od Bio‑Rad Laboratories, Inc., mikroskop CX21 je bil od Olympus Co., Ltd. , sistem za slikanje z gelom GIS‑2019 je bil od Tanon Science and Technology Co., Ltd., plošča z ravnim dnom je bila od Corning Inc., pretočna citometrija EPICS-XL od Beckman-Coulter Inc., StepOnePlus Real-Time polimerazna verižna reakcija (PCR) je bil iz Thermo Fisher Scientific.

Kemikalije in reagenti

GC smo pripravili v našem laboratoriju kot prej opisano metodo [14] in z ultravijolično spektrofotometrijo je bilo ugotovljeno, da je čistost GC 52 odstotkov (akteozid je bil uporabljen kot marker za določanje GC). Estradiol (E2) je bil kupljen pri Yuanye Biotechnology Co., Ltd. (Šanghaj, Kitajska). Fetalni goveji serum (FBS) in RPMI‑1640 sta bila podjetja Gibco Co., Ltd., plošča s 96 vdolbinicami z ravnim dnom je bila podjetja Corning Inc., dimetil sulfoksid (DMSO) in 3-[4,5-dimetil-2-tiazolil ]-2,5-difeniltetrazolijev bromid (MTT) so kupili pri Sigma-Aldrich Corporation. Reagent TRIzol, komplet za reverzno transkripcijo (RT) in komplet TB Green™ RT‑PCR so bili kupljeni pri TaKaRa Co., Ltd., Dalian, Kitajska. Anti-ER Rabbit pAb, anti-ER Rabbit pAb in ‑aktinska protitelesa so bila kupljena pri Wanlei Biotechnology Co., Ltd. Vse druge običajne kemikalije so bile kupljene pri standardnih komercialnih dobaviteljih.

Priprava vzorca

Priprava osnovne raztopine glikozidov Cistanches

Ekstrakt GC smo raztopili v DMSO, da smo naredili osnovno raztopino s koncentracijo 0.1051 g/ml in shranili pri 4 stopinjah. RPMI‑1640 brez fenolnega rdečega je bil uporabljen za redčenje osnovne raztopine na različne koncentracije pred uporabo.

Priprava osnovne raztopine estradiola

Ekstrakt E2 smo raztopili v DMSO, da smo naredili osnovno raztopino s koncentracijo 0.27 mg/ml in shranili pri 4 stopinjah. RPMI‑1640 brez fenolnega rdečega je bil uporabljen za redčenje osnovne raztopine na različne koncentracije pred uporabo.

Priprava fetalnega govejega seruma, obdelanega z dekstranom

Na stotine mililitrov FBS smo zmešali z 250 mg aktivnega oglja v prahu in 25 mg dekstrana. Po 45-minutni inkubaciji pri 55 stopinjah smo mešanico 15 minut centrifugirali pri 4 stopinjah, 1000 rpm. Supernatant smo filtrirali z uporabo membrane Millipore Express PES, da smo dobili FBS, obdelan z dekstranom (CDT), in shranili pri –20 stopinjah.

Kultura celic

Celične linije človeškega raka dojke MCF-7 so bile pridobljene iz ameriške zbirke tipskih kultur (ATCC). Poleg tega so celice gojili z medijem RPMI‑1640, ki je vseboval 10 odstotkov FBS in 1 odstotek penicilin-streptomicina pri 37 stopinjah pod vlažno atmosfero s 5 odstotki CO2. Celice so gojili v mediju RPMI‑1640 brez fenolnega rdečega, ki je vseboval 5 odstotkov CDT-FBS 4 dni pred testom MTT, tako da je bilo treba estrogen v celicah očistiti.

Analiza celične proliferacije estradiola na celičnih linijah MCF-7

Proliferacijo celic smo izmerili s testom MTT za celice MCF-7.[15,16] E2 smo raztopili v gojišču RPMI-1640, ki je vsebovalo 0.1 odstotka DMSO pri končni koncentraciji {{27 }}.1, 1, 10, 100 in 1000 nM. Celične linije MCF-7 smo 4 dni gojili v mediju RPMI-1640 brez fenolnega rdečega. Po trikratnem izpiranju s fiziološko raztopino s fosfatnim pufrom (PBS) smo dodali 100 µL medija RPMI-1640 brez FBS v plošče s 96 vdolbinicami pri 1,5 × 104 na vdolbinico in inkubirali pri 37 stopinjah 24 ur. Nato smo celice 72 ur obdelali z različnimi koncentracijami raztopine E2. Nato smo v vsako vdolbinico dodali 100 µL raztopine MTT (0,5 mg/mL). Celice smo inkubirali 4 ure. Nazadnje smo dodali 150 µL DMSO, da smo raztopili kristale formazana. Absorbanco smo izmerili pri 570 nm z čitalcem mikroplošč in izračunali stopnjo proliferacije (PR).

Analiza celične proliferacije glikozidov Cistanches na celičnih linijah MCF-7

Proliferacijo celic smo izmerili s testom MTT za celice MCF-7. GC so bili raztopljeni v gojišču RPMI‑1640, ki je vsebovalo 0.1 odstotka DMSO pri končnih koncentracijah 0.0175, 0,175, 1,75, 17,5 in 175 µg /ml. Celične linije MCF‑7 so 4 dni gojili v mediju RPMI‑1640 brez fenolnega rdečega, ki je vseboval 5 odstotkov CDT‑FBS. Po trikratnem izpiranju s PBS smo 100 µL medija RPMI-1640 brez FBS dodali v plošče s 96 vdolbinicami pri 1,5 × 104 na vdolbinico in inkubirali pri 37 stopinjah 24 ur. Nato smo celice obdelali z različnimi koncentracijami raztopine GCs 24, 48 oziroma 72 ur. Nato smo v vsako vdolbinico dodali 100 µL raztopine MTT (0,5 mg/mL). Celice smo inkubirali 4 ure. Nazadnje smo dodali 150 µL DMSO, da smo raztopili kristale formazana. Absorbanco smo izmerili pri 570 nm z čitalcem mikroplošč in izračunali PR. RPMI‑1640 brez fenolnega rdečega in medij, ki je vseboval E2 (2,725 × 10-3 µg/ml), sta bili negativna oziroma pozitivna skupina.

Analiza celične proliferacije glikozidov Cistanches s fulvestrantom na celičnih linijah MCF-7

Proliferacijo celic smo izmerili s testom MTT za celice MCF-7. GC smo raztopili v gojišču RPMI‑1640, ki je vsebovalo 0,1 odstotka DMSO pri končnih koncentracijah 1,75, 17,5 in 175 µg/ml. Celične linije MCF‑7 so 4 dni gojili v mediju RPMI‑1640 brez fenolnega rdečega, ki je vseboval 5 odstotkov CDT‑FBS. Po trikratnem izpiranju s PBS smo 100 µL medija RPMI-1640 brez FBS dodali v plošče s 96 vdolbinicami pri 1,5 × 104 na vdolbinico in inkubirali pri 37 stopinjah 24 ur. Nato smo celice obdelali z različnimi koncentracijami raztopine GC in inkubirali s fulvestrantom (6, 06 × 10-5 µg / ml) 48 ur. Nato smo v vsako vdolbinico dodali 100 µL raztopine MTT (0,5 mg/mL). Celice smo inkubirali 4 ure. Nazadnje smo dodali 150 µL DMSO, da smo raztopili kristale formazana. Absorbanco smo izmerili pri 570 nm z čitalcem mikroplošč in izračunali PR. RPMI‑1640 brez fenolnega rdečega in medij, ki je vseboval E2 (2,725 × 10-3 µg/ml), sta bili negativna oziroma pozitivna skupina.

Test celičnega cikla

GC smo raztopili v gojišču RPMI‑1640, ki je vsebovalo 0.1 odstotka DMSO pri končnih koncentracijah 1,75, 17,5 in 175 µg/ml. Celične linije MCF-7 so bile 4 dni gojene v mediju RPMI-1640 brez fenolnega rdečega, ki je vseboval 5 odstotkov CDT-FBS. Po trikratnem izpiranju s PBS je bil dodan 1 ml medija RPMI-1640 brez FBS v plošče s 6 vdolbinicami pri 2,5 × 105 na vdolbinico in inkubiran pri 37 stopinjah 24 ur. Nato smo celice obdelali z različnimi koncentracijami raztopine GC in inkubirali s fulvestrantom (6, 06 × 10-5 µg / ml) 48 ur. Nato smo celice zbrali in trikrat sprali s PBS, centrifugirali pri 4 stopinjah, 1000 rpm 10 minut in fiksirali s 70-odstotnim etanolom pri -20 stopinjah čez noč. Po dvakratnem izpiranju s PBS so bile celice obarvane z raztopino PI (50 mg/mL), ki je vsebovala 1 mg/mL RNaze A in 0,1 odstotka Triton X-100 30 minut v temi pri 4 stopinjah. Celični cikel smo odkrili s pretočno citometrijo in indeks proliferacije (PI) izračunali na naslednji način. RPMI‑1640 brez fenolnega rdečega in medij, ki je vseboval E2 (2,725 × 10-3 µg/ml), sta bili negativna oziroma pozitivna skupina. PI=(S plus G2 M)/(G0 /G1 plus S plus G2 M) × 100 odstotkov

Izolacija RNA in kvantitativna analiza verižne reakcije s polimerazo v realnem času

Za merjenje ravni mRNA je bil uporabljen RT-kvantitativni test PCR (qPCR). Celotno celično RNA smo ekstrahirali z reagentom TRIzol. Za qPCR je bila RNA obratno prepisana v cDNA iz 4 µg celotne RNA z uporabo kompleta RT. Analize RT-PCR so bile izvedene s kompletom TB Green™ RT-PCR. Vsi protokoli so bili izvedeni po navodilih proizvajalca. Par primerjev, uporabljen za pomnoževanje ER, je bil 5'-GGGAAGTATGGCTATGGAATCTG-3' (naprej) in 5'-TGGCTGGACACATATAGTCGTT-3' (nazaj); par primerjev, uporabljen za pomnoževanje ER, je bil 5'-AGTGCCGCTCTTGGAGAGCTG-3' (naprej) in 5'-CCTGGGTCGCTGTGACCAGA-3' (nazaj). Pogoji PCR za ER in ER so bili 94 stopinj za 3 minute, čemur je sledilo 37 oziroma 40 ciklov, in sicer 94 stopinj za 30 s, 58 stopinj za 2 minuti in 72 stopinj za 2 minuti. Par primerjev, uporabljen za pomnoževanje GAPDH, je bil 5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3' (naprej) in 5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3' (nazaj). Pogoji PCR za GAPDH so bili 94 stopinj 3 minute, čemur je sledilo 30 ciklov 94 stopinj 30 s, 58 stopinj 2 minuti in 72 stopinj 2 minuti. Vsakič, ko je bil poskus RT‑qPCR ponovljen več kot dvakrat. Za to je bil GAPDH uporabljen kot notranji nadzor. Izračunana je bila relativna genska ekspresija ER /ER transfektantov glede na kontrolne celice: 2-(∆∆Ct).

Western blotting

Ekspresija ER in ER proteinov je bila odkrita z Western blot analizo kot prijavljena metoda z manjšimi modifikacijami. Na kratko, celice MCF-7 smo gojili v ploščah s 6 vdolbinicami pri 2, 5 × 105 celic na vdolbinico in obdelali z GC pri končni koncentraciji 1, 75, 17, 5 in 175 µg / ml 48 ur. Po inkubaciji so bili ekstrakti celih celic pripravljeni z uporabo pufra RIPA, ki je vseboval 1 mM PMSF. Beljakovine v izvlečkih celih celic so bile ločene z elektroforezo v 12-odstotnem natrijevem dodecil sulfatu-poliakrilamidnem gelu in nato prenesene na membrane iz poliviniliden difluorida. Membrana je bila blokirana s 5 odstotki (w/v) posnetega mleka, raztopljenega v pufru TBST, in inkubirana s primarnimi in sekundarnimi protitelesi po vrsti. Opazili so vezana protitelesa.

Statistična analiza

Rezultati so bili izraženi kot srednje vrednosti in standardni odkloni, statistična značilnost pa je bila izvedena z uporabo Studentovega t-testa s programsko opremo SPSS 21.0 (IBM Co., Ltd. Amerika). p<0.05 was="" considered="" statistically="">

REZULTATI

Po 24 urah zdravljenja z E2 je bila proliferacija celic MCF-7 očitno povečana [slika 1a]. 10 nM raztopine E2 bi lahko očitno spodbudilo rast celic (123,89 odstotka). S povečanjem koncentracije E2 pa je sposobnost celične proliferacije oslabela. Zato je bila 10 nM optimalna koncentracija E2 v tem poskusu.

Skupina GC pri koncentracijah 1,75, 17,5 in 175 µg/mg je lahko povečala proliferacijo celičnih linij MCF-7 na način, ki je odvisen od časa in odmerka, in je pokazala pomembno razliko z negativno skupino [slika 1b]. V primerjavi z negativno skupino je skupina E2 pokazala očitno proliferacijo (120,06 odstotka).

Skupina kombiniranih zdravil (CMG) (fulvestrant z E2 ali GC) v mediju CDT-FBS je bila inkubirana s celicami MCF-4. Po 72 urah inkubacije lahko CMG povzroči naklon PR v primerjavi s posamezno skupino zdravil (IMG) (P < 0,01)="" [slika="">

Analiza pretočne citometrije je pokazala, da lahko GC nekoliko povečajo vrednost PI, kar nakazuje, da lahko GC napredujejo celice faze G{{0}}/G1 v fazi S in G2/M [slika 2 in tabela 1] ter spodbujajo celično DNA sinteza. Rezultat, ki kaže, da je bil mehanizem GC na MCF-7 podoben mehanizmu E2. V CMG (fulvestrant z GC) se je vrednost PI celice PI rahlo znižala na vrednost IMG (P <>

Analiza RT-PCR je pokazala, da je bilo izražanje ER in mRNA ER povečano v primerjavi s kontrolno skupino (P < 0.01) v odvisnosti od odmerka po zdravljenju z različnimi koncentracijami GC 48 ur [slika 3a in b].

Rezultat Western blota, ki kaže, da se po 48-urnem zdravljenju z različnimi koncentracijami GC vsebnost ER in proteinov ER v MCF-7 poveča s povečanjem GC na način, ki je odvisen od odmerka [slika 3c-e]

ZAKLJUČEK

V tej raziskavi je bil učinek GC na proliferacijo in celični cikel MCF-7 testiran z metodo MTT oziroma s pretočno citometrijo. GC lahko povečajo proliferacijo celic MCF-7 pri koncentracijah 1,75, 17,5 in 175 µg/ml po 72-urni inkubaciji. Vendar se povečanje običajno upočasni, če se CC in fulvestrant uporabljajo skupaj. GC lahko povečajo vrednost PI celic MCF-7, zmanjšajo celico faze G1 in povečajo celico faz S in G2.

Fulvestrant je antagonist, specifičen za ER, ki blokira jedrno lokalizacijo ER tako, da oslabi dimerizacijo receptorjev in od energije odvisen jedrski transport.[17] V tej raziskavi je zaključek potrdil, da lahko fulvestrant oslabi proliferacijo GC na celicah MCF‑7 in lahko vpliva na transformacijo celičnega cikla. Zato je ta študija pokazala estrogensko aktivnost GC, prav tako pa je ER tarča GC. V poskusu RT-PCR in Western blot se je ekspresija mRNA in beljakovin ER in ER v celicah MCF-7 povečala s povečanjem koncentracije GC. Zato lahko GC igrajo vlogo pri estrogenski aktivnosti glede na regulirano mRNA in proteine ​​ER in ER .