Interferenca feniletanoidnih glikozidov iz Cistanche Tubulosa s testom MTT

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

Yu-Jie Wang, Si-Min Zhou, Gang Xu in Yu-Qi Gao

Povzetek:

Test MTT kot presejalna metoda se pogosto uporablja za merjenje sposobnosti preživetja in proliferacije celic. Vendar je treba opozoriti, da test MTT morda ne odraža natančno učinkaCistanche tubulosaetanolnega ekstrakta na viabilnost celic EA.hy926. Da bi raziskali in identificirali sestavine, ki so odgovorne za protislovna opažanja testa MTT, smo iz etanolnega ekstrakta C. tubulosa izolirali dva glavna feniletanoidna glikozida, ehinakozid in akteozid. Podatki, pridobljeni s testi CCK-8, Hoechst 33342 in aneksin V-FITC/PI, kažejo, da je bila kofeoilna skupina, prisotna v obeh izoliranih spojinah, odgovorna za nasprotujoče si rezultate testa MTT. Ti podatki poudarjajo potrebo po uporabi različnih metod za določanje učinka zdravilnih učinkovin na sposobnost preživetja celic, da bi se izognili ustvarjanju zavajajočih rezultatov.

Ključne besede: MTT test;feniletanoidni glikozid; kofeinska kislina; sposobnost preživetja celic; motnje

Uvod

Parazitska rastlinaCistanche tubulosa(Schrenk) R. Wight (družina Orobanchaceae) je zelo razširjena v severnoafriških, arabskih in azijskih državah [1]. Izhaja izCistanche tubulosainCistanche deserticolaso pomembni v tradicionalni kitajski medicini, saj so jih uporabljali za zdravljenje impotence, sterilnosti, lumbaga in zaprtja zaradi vztrajnosti debelega črevesa [2]. Poleg tega se je pokazalo, da ima etanolni izvleček Cistanche tubulosa pomemben zaščitni učinek proti cerebralni hipoksiji pri miših [3].

Endotelne celice igrajo ključno vlogo pri patogenezi hipoksične pljučne hipertenzije. Endotelna celična linija EA.hy926 je precej podobna primarnim endotelnim celicam. Med lastno študijo antihipoksičnega učinkaCistanche tubulosaetanolnega ekstrakta na endotelijskih celicah EA.hy926 smo opazili, da 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijev bromid (MTT) test, ki se običajno uporablja za oceno viabilnosti celic v študijah citotoksičnosti in citostatske aktivnosti, je ustvaril nasprotujoče si rezultate, saj je pokazal povečano viabilnost celic EA.hy926 po zdravljenju.

Natančna ocena viabilnosti celic je bistvena za identifikacijo morebitnih citotoksičnih ali citoprotektivnih učinkov zdravila. Zato smo raziskali, katere komponente, prisotne v etanolnem izvlečku C. tubulosa, so lahko odgovorne za nasprotujoče si rezultate, opažene pri testu MTT. Izolirali smo dva glavna feniletanoidna glikozida (PhG) iz etanolnega ekstrakta C. tubulosa, ehinakozid (v nadaljevanju spojina 1) in akteozid (v nadaljevanju spojina 2), ter z različnimi metodami določili njun učinek na viabilnost celic EA.hy926. Poleg tega, da bi dodatno razjasnili, kateri substituent spojin 1 in 2 je lahko odgovoren za protislovne rezultate, smo testirali njihove aglikone, kofeinsko kislino (v nadaljevanju spojina 3) in 3,4-dihidroksilfeniletanol (v nadaljevanju spojina 4), na viabilnost celic EA.hy926 z istimi metodami.

Rezultati in razprava

Identifikacija spojin

Strukturi dveh spojin, izoliranih iz etanolnega ekstrakta C. tubulosa, sta bili identificirani z analizami jedrske magnetne resonance (NMR) in masne spektrometrije (MS) in sta prikazani na sliki 1. Spojina 1 je bila identificirana kot ehinakozid v primerjavi s prej prijavljenim NMR (tabela 1) in podatki MS (m/z 785 [M-H]-) [4]. NMR spektri spojine 2 so bili zelo podobni spektrom spojine 1, razen odsotnosti -D-glukopiranozilne skupine (tabela 1). Spojina 2 (m/z 623 [M-H]-) je bila identificirana kot akteozid [5]. Pomembno je, da imata obe spojini isti aglikon, ki vključuje kofeinsko kislino (spojina 3) in 3,4-dihidroksilfeniletanol (spojina 4).

Testi viabilnosti celic

Za analizo učinka spojin 1–4 na viabilnost celic EA.hy926 sta bila uporabljena testa MTT in CCK{{0}}. Preizkus MTT je pokazal, da se je sposobnost preživetja celic EA.hy926 znatno povečala po zdravljenju s 25 in 50 μM spojino 1, 2 ali 3 (166,3 odstotka in 174,1 odstotka za spojino 1, 205,8 odstotka in 224,3 odstotka za spojino 2 in 164,8 odstotka oziroma 189,6 odstotka za spojino 3; p < 0,05)="" v="" primerjavi="" s="" kontrolnimi="" celicami="" (slika="" 2a).="" poleg="" tega="" je="" morfološki="" pregled="" celic="" ugotovil,="" da="" je="" zdravljenje="" s="" 50="" μm="" spojine="" 1,="" 2="" ali="" 3="" povečalo="" tvorbo="" vijoličnih="" kristalov="" formazana,="" ki="" veljajo="" za="" neposreden="" pokazatelj="" deleža="" živih="" celic="" (slika="" 3).="" nasprotno="" pa="" je="" test="" cck-8="" pokazal,="" da="" se="" je="" viabilnost="" celic="" znatno="" zmanjšala="" po="" zdravljenju="" z="" 12,5,="" 25="" in="" 50="" μm="" spojine="" 1,="" 2="" ali="" 3="" (75,5="" odstotka,="" 45,1="" odstotka="" in="" 43,7="" odstotka="" za="" spojino="" 1,="" 85,5="" odstotka,="" 51,8="" odstotka="" in="" 34,3="" odstotka="" za="" spojino="" 2="" oziroma="" 64,5="" odstotka,="" 48,2="" odstotka="" oziroma="" 36,4="" odstotka="" za="" spojino="" 3;="" p="">< 0,05)="" v="" primerjavi="" s="" kontrolnimi="" celicami="" (slika="" 2b).="" spojina="" 4="" ni="" vplivala="" na="" viabilnost="" celic="" niti="" v="" testu="" mtt="" niti="" v="" cck-8.="" neskladje="" med="" rezultati,="" dobljenimi="" z="" obema="" testoma,="" nakazuje,="" da="" eden="" od="" obeh="" testov="" morda="" ne="" odraža="" natančno="" učinkov="" spojin="" 1="" in="" 2="" na="" sposobnost="" preživetja="" celic="">

Ocena apoptoze z barvanjem po Hoechstu

Hoechst 33342 je za celice prepusten DNA madež, ki ga vzbuja ultravijolična svetloba in oddaja modro fluorescenco pri 460 do 490 nm. Kondenzirani kromatin apoptotičnih celic se obarva svetlejše kot kromatin normalnih celic [6]. Medtem ko so kontrolne celice pokazale enakomerno razpršen kromatin, normalne organele in nedotaknjene celične membrane, so celice, inkubirane s 50 μM spojin 1, 2 ali 3 48 ur, pokazale tipično obarvanje apoptotičnih celic (slika 4A). Nasprotno pa izpostavljenost celic 50 μM spojine 4 ni povečala števila apoptotičnih jeder v primerjavi s kontrolnim zdravljenjem.

Pretočna citometrična analiza apoptotičnih celic

Test dvojnega obarvanja z aneksinom V-FITC/PI identificira apoptotične celice z visoko afinitetno vezavo aneksina V-FITC na fosfatidilserin, ki se eksternalizira v celicah, ki so podvržene apoptozi [7]. V tem testu se preživete celice ne vežejo niti na aneksin V niti na PI in zato niso obarvane (spodnji levi kvadrant), zgodnje apoptotične celice so obarvane zeleno z vezavo aneksina V-FITC (spodnji desni kvadrant) in pozne apoptotične celice se obarvajo zeleno in rdeče zaradi vezave aneksina V-FITC na fosfatidilserin oziroma PI na nekrotične celice (zgornji desni kvadrant). Kot je prikazano na sliki 4B, se je v celicah, inkubiranih s 50 μM spojin 1, 2 ali 3 48 ur, odstotek apoptotičnih celic povečal s 3,74 odstotka (kontrolne celice) na 10,32 odstotka, 12,95 odstotka oziroma 11,30 odstotka. V primerjavi s kontrolnimi celicami spojina 4 ni povečala odstotka apoptotičnih celic EA.hy926.

V skladu z rezultati, pridobljenimi s testom CCK-8 in barvanjem s Hoechst 33342, je test s pretočno citometrijo pokazal, da spojine 1, 2 in 3 inducirajo apoptozo v celicah EA.hy926. Ta opažanja skupaj kažejo, da je povečanje viabilnosti celic EA.hy926, opaženo s testom MTT po zdravljenju s spojinami 1–3, predstavljalo lažno pozitiven rezultat.

Diskusija

Leta 1983 je Mosmann razvil kolorimetrični MTT mikroploščni test za merjenje celične proliferacije in citotoksičnosti [8]. Ta preprosti test in njegove modifikacije se zdaj v veliki meri uporabljajo v laboratorijih celične biologije po vsem svetu. Študije frakcioniranja v celicah sesalcev so pokazale, da je reducirani piridinski nukleotidni kofaktor, NADH, odgovoren za večino zmanjšanja MTT. To so podprle študije s celimi celicami [9]. Zmanjšanje MTT je torej povezano s presnovno aktivnimi celicami in ni povezano le z mitohondrijskim dihanjem, ampak tudi s citoplazmo in nemitohondrijskimi membranami, vključno z endosomskim/lizosomskim predelom in plazemsko membrano [10]. Neto pozitivni naboj na molekuli MTT je primarni dejavnik za njen celični privzem preko potenciala plazemske membrane.

Predvsem test MTT morda občasno ne odraža natančno dejanskega učinka, ki ga ima testirana spojina na specifične celice. Vendar kemične strukture ali skupine, ki bi lahko povzročile nasprotujoče si rezultate v testu MTT, niso bile identificirane. Nedavne študije so pokazale, da lahko test MTT podceni antiproliferativni učinek (-)-epigalokatehin-3-galata, najbolj razširjenega polifenola v zelenem čaju [11]. V študijah z uporabo testa MTT za odkrivanje kemosenzitivnosti tumorja so kemoterapevtiki proti raku, kot so epirubicin, paklitaksel, docetaksel in imatinib mezilat (Gleevec), pokazali povečano sposobnost preživetja celic [12,13]. Poleg tega so številne študije poročale, da bi nekateri rastlinski izvlečki in redoks-aktivni polifenoli lahko vplivali na test MTT, saj neposredno zmanjšajo tetrazolijevo sol MTT v odsotnosti celic [14].

Potreba po raztapljanju kristalov formazana MTT pred spektrofotometrično analizo v bralniku mikroplošč in inherentna narava končne točke reakcije omejujejo uporabo testa MTT na določene aplikacije. To je vodilo do razvoja analogov tetrazolija, v katerih so bili fenilni deli okrašeni z negativno nabitimi sulfonatnimi skupinami, kot je 2,3-bis-(2-metoksi-4-nitro- 5- sulfofenil)-2H-tetrazolijev-5-karboksamid (XTT), negativno nabita notranja sol [15] in 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) -5-(3-karboksimetoksifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolij (MTS), šibko kisla notranja sol, tesno povezana z MTT [16] . Te modifikacije so povzročile proizvodnjo produktov formazana, topnih v gojišču kulture, ki so odpravili zahtevo po koraku solubilizacije pred kvantitacijo. Skladno s tem, ko je povečan negativni naboj na teh molekulah zmanjšal njihovo sposobnost premikanja skozi celične membrane [17], so se pojavili vmesni akceptorji elektronov (IEA), kot je 1-metoksi-5-metil fenazinijev metil sulfat ({{25 }}metoksi PMS) so bili potrebni za olajšanje redukcije tetrazolnega barvila ali za povečanje stopnje redukcije.

Nedavno je bila razvita nova generacija vodotopnih tetrazolijevih soli, katerih prototip je WST-1 [18]. WST-1, negativno nabita disulfonirana notranja sol, ki vsebuje ostanek joda, je stabilnejša od XTT in MTS v prisotnosti 1-metoksi PMS, njenega obveznega IEA. To je vodilo do trženja WST-1/1-metoksi PMS kot priročnega kompleta za celično proliferacijo z enim reagentom. Razvitih je bilo več drugih tetrazolijevih soli v seriji WST, od katerih je morda najbolj uporabna WST-8 [19]. Zdi se, da ima WST-8 zelo podobne lastnosti celične redukcije kot WST-1 in se trži neodvisno kot test CCK-8. WST-8 je celično neprepusten in se zato reducira zunajcelično, s transportom elektronov iz intracelularnega NADH v WST-8 preko plazemske membrane, ki ga posreduje 1-metoksi PMS. Čeprav zmanjšanje MTT in WST-8/1-metoksi PMS poganja znotrajcelični NADH, se zdi, da se vir NADH razlikuje znotraj teh dveh metod. WST-8/1-metoksi PMS zmanjšanje je bolj odvisno od malat/aspartat shuttle, ki povezuje mitohondrijski trikarboksilni kislinski cikel-NADH z ekstramitohondrijskim prostorom [20].

V preliminarnih poskusih smo potrdili, da spojine 1, 2, 3 in 4 ne morejo neposredno reducirati tetrazolijeve soli MTT (ni prikazano). V tej študiji je bil neposredni vpliv samih spojin z reagentom izločen s skrbnim izpiranjem mikroplošč s fiziološko raztopino s fosfatnim pufrom (PBS), preden smo dodali raztopino MTT ali CCK-8, kot je navedeno v protokolih proizvajalca. Kljub temu so bili rezultati, dobljeni z uporabo obeh metod, še vedno protislovni (slika 2). Kot je bilo pričakovano, je inkubacija celic s spojinami 1, 2 in 3 povečala redukcijo tetrazolijeve soli v vijolični formazan v primerjavi s kontrolno skupino (slika 3), kar kaže, da je zgolj redukcija tetrazolijeve soli v prisotnosti specifične spojine ne zadostuje za presojo sposobnosti spojine, da vpliva na test MTT.

Da bi ugotovili, ali lahko spojine 1, 2, 3 in 4 inducirajo apoptozo v celicah EA.hy926, so bile ocenjene celične morfološke spremembe in eksternalizacija fosfatidilserina. Skladno z zmanjšanjem celične sposobnosti preživetja, opaženim s testom CCK-8, so rezultati Hoechstovega barvanja in analize pretočne citometrije z uporabo aneksina V-FITC/PI pokazali, da je bila inhibicija rasti, opažena po zdravljenju s spojino 1, 2 in 3, vsaj delno zaradi apoptoze celic EA.hy926. Naši rezultati so podprli tudi idejo, da je kafeoilna skupina, prisotna v obeh spojinah 1 in 2, odgovorna za protislovne rezultate, dobljene s testom MTT.

Podobno kot naše ugotovitve, Rottlerin, močan odpirač kalijevih kanalov z veliko prevodnostjo, ni pokazal reaktivnosti proti MTT in vitro. Vendar pa je močno povečal tvorbo kristalov formazana v celicah, rezultat, ki je bil v očitnem nasprotju z Rottlerinovo inhibicijo NF-κB in celično proliferacijo, opaženo z analizo vgradnje [3H]-timidina v DNA [21]. Mehanizem, s katerim je Rottlerin povečal zmanjšanje MTT, je bil pripisan njegovemu učinku ločevanja mitohondrijev [22]. Rottlerin ima skupino substituentov cinamoilne kisline. V primerjavi s cinamoilno kislino ima spojina 3 dva dodatna hidroksilna ostanka, ki se nahajata pri C-3 in C-4. Zato špekuliramo, da je mehanizem, s katerim spojini 1 in 2 povzročata nasprotujoče si rezultate v testu MTT, lahko povezan tudi z njihovimi učinki ločevanja mitohondrijev. Za preizkušanje te hipoteze so potrebne primerjalne študije med spojinami 1, 2 in kemičnim ločilnikom, kot je trifluorokarbonilcianid fenilhidrazon (FCCP).

Eksperimentalni oddelek

Reagenti in kemikalije

Spojina 3 (kafeinska kislina v prahu, čistost=98.6 odstotkov) je bila kupljena pri Chengdu Push Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Kitajska). Spojino 4 (3,4-dihidroksilfeniletanol–olje, čistost=98.5 odstotkov) smo pridobili pri Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Kitajska). MTT in dimetil sulfoksid (DMSO) sta bila pridobljena pri Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, ZDA). Test CCK-8 je bil kupljen pri Dojin Laboratories (Kumamoto, Japonska). Kompleti za odkrivanje apoptoze Hoechst 33342 in aneksin V-FITC/PI so bili kupljeni pri Beyotime Institute of Biotechnology (Haimen, Kitajska)

Rastlinski material

Stebla C. tubulosa so bila zbrana v prefekturi Yutian, avtonomna regija Xinjiang Uygur, Kitajska. Vzorci vavčerjev so bili deponirani v Key Laboratory of High Altitude Medicine, Third Military Medical University (Chongqing, Kitajska) in jih je overil Yi Zhang z Univerze tradicionalne kitajske medicine Chengdu (Chengdu, Kitajska).

Ekstrakcija in izolacija rastlinskega materiala

Na zraku posušena stebla C. tubulosa (0.6 kg) so bila zdrobljena v prah in ekstrahirana s 50 odstotki etanola 2 uri pri 70 stopinjah. Po odstranitvi topila pod znižanim tlakom smo etanolni ekstrakt (212,5 g) raztopili in suspendirali v vodi (2 L) ter ekstrahirali z n-butanolom (2 L × 3). N-butanolski ekstrakt (110 g) smo kromatografirali na poliamidni koloni in eluirali z etanolom/vodo (0:100, 5:95, 15:85, 30:70, 50:50), pri čemer smo dobili pet frakcij (A–E) . Frakcijo B (65 g) smo frakcionirali na ODS koloni; eluiranje z etanolom:voda (1:9) loči spojino 1 (3 g). Frakcijo D (10,5 g) smo frakcionirali na ODS koloni; eluiranje z etanolom/vodo (1:4) loči spojino 2 (1 g).

NMR spektri so bili posneti na spektrometru Bruker Avance 600 v CD3OD s tetrametilsilanom (TMS) kot internim standardom. Masni spektri so bili izvedeni na masnem spektrometru BioTOF-Q.

Celična kultura

Celične linije EA.hy926 so bile pridobljene iz American Type Culture Collection (Manassas, VA, ZDA). Celice smo gojili v mediju RPMI 1640, dopolnjenem z 10 odstotki (v/v) fetalnega govejega seruma in 1 odstotkom (v/v) penicilin-streptomicina v vlažnem okolju s 5 odstotki CO2 pri 37 stopinjah.

Viabilnost celic

Preživetje celic je bilo ocenjeno z uporabo testov MTT in CCK{{0}}. Spojini 1 in 2 ter njuni aglikoni, kofeinska kislina (3) in 3,4-dihidroksilfeniletanol (4) smo raztopili v DMSO do končne koncentracije DMSO < 0,1="" odstotka="" (v/v)="" v="">

Celice EA.hy926 smo zasejali na 96-plošče z vdolbinicami pri 4 × 103 celic/vdolbinico. Po 24-urni inkubaciji smo celice 24 ur obdelali s 6,25–50 μM spojine 1, 2, 3 ali 4. Gojišče smo odstranili in celice dvakrat sprali s fosfatno pufrano slanico (PBS). Alikvote (10 μL) osnovne raztopine MTT (5 mg·mL-1) dodamo v vsako vdolbino, ki vsebuje 100 μL medija, in inkubiramo s celicami 4 ure. Po inkubaciji smo medij odstranili in v vsako vdolbinico dodali 150 μL alikvote DMSO, da solubilizirali kristale formazana. Absorbanco smo izmerili pri 490 nm z bralnikom mikroplošč (Bio-Tek Synergy HT, Winooski, VT, ZDA). Viabilnost celic je bila izražena kot odstotek zmanjšanja MTT, pri čemer je bila 100-odstotna vrednost dodeljena absorbanci kontrolnih celic. Vsi poskusi so bili izvedeni trikrat in predstavljeni kot povprečje ± standardni odklon (SD).

Test CCK-8 je bil izveden v skladu z literaturo z manjšimi spremembami [23]. Natančneje, celice smo 24 ur obdelali s 6,25–50 μM spojin 1, 2, 3 ali 4 in jih dvakrat sprali s PBS pred dodatkom 10 μL raztopine CCK-8 in 100 μL gojišča. Po inkubaciji mikroplošče pri 37 stopinjah 2 uri smo absorbanco izmerili pri 450 nm z uporabo bralnika mikroplošč. Viabilnost celic je bila izražena kot odstotek sposobnih celic glede na kontrolne celice (100 odstotkov). Vsi poskusi so bili izvedeni trikrat in izraženi kot povprečje ± SD.

Ocena apoptoze z barvanjem Hoechst 33342

Apoptotične morfološke spremembe so opazili z barvanjem s Hoechst 33342. Na kratko, celice EA.hy926 so bile posejane na 48-plošče z vdolbinicami (2 × 104 celic/vdolbinico) in obdelane s 50 μM spojine 1, 2, 3 ali 4 48 ur pri 37 stopinjah, dvakrat sprane s PBS, in fiksiramo s 4 odstotki (v/v) paraformaldehida 15 minut pri sobni temperaturi. Po dvakratnem izpiranju s PBS smo celice obarvali s Hoechst 33342 (10 ug·mL-1) 5 minut pri sobni temperaturi in dvakrat sprali s PBS. Jedra, obarvana s Hoechstom, smo vizualizirali s fluorescenčnim mikroskopom (Olympus, Tokio, Japonska).

Analiza apoptoze s pretočno citometrijo

Apoptotične celice so bile odkrite z dvojnim barvanjem z aneksinom V-FITC/PI in analizo s pretočno citometrijo. Na kratko, po obdelavi s 50 µM spojine 1, 2, 3 ali 4 48 ur smo celice pobrali in resuspendirali v PBS pri 1 × 105 celic · mL-1. Po centrifugiranju pri 500 × g 5 minut pri 25 stopinjah smo dodali 195 μL pufra za vezavo aneksina V-FITC in 5 μL aneksina V-FITC. Po nežnem vrtinčnem mešanju smo zmes inkubirali 10 minut pri sobni temperaturi v temi. Po centrifugiranju pri 500 × g 5 minut pri 25 stopinjah smo dodali 190 μL FITC-konjugiranega pufra za vezavo aneksina V in 10 μL PI. Po nežnem vrtinčnem mešanju smo vzorce analizirali s pretočnim citometrom FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, ZDA) v 30 minutah.

Statistična analiza

Vsi eksperimentalni podatki so bili izraženi kot povprečje ± SD. Pomembnost razlik med poskusnimi vzorci in pripadajočo kontrolo smo ocenili z enosmerno analizo variance (ANOVA) s programsko opremo SPSS (verzija 11.5). Statistična značilnost je bila nastavljena na p <>

Sklepi

Naši rezultati kažejo, da bi lahko precenjevanje števila živih celic, opaženih v testu MTT, prikrilo citotoksičnost nekaterih spojin. Zato med postopki presejanja zdravil priporočamo uporabo različnih metod za določanje učinka določene spojine na sposobnost preživetja celic (kot so testi CCK-8 in 3 H-TdR), da se izognete ustvarjanju zavajajočih rezultatov.