In vitro okužba celic goveje ledvice Madin-Darby (MDBK) s sporozoiti Eimeria Acervulina: kvantitativna analiza parazitske celične invazije in replikacije z uporabo verižne reakcije s polimerazo (PCR) v realnem času

edmund.chen@wecistanche.com

Povzetek

Kokcidioza perutnine povzroča znatne gospodarske izgube v živinorejski industriji. Za to bolezen so odgovorni paraziti Eimeria. V svetovnem merilu sta E. acervulina in E. tenella med najpogostejšimi Eimeria spp. okužba brojlerjev. E. tenella se običajno uporablja kot model okužbe in vivo in in vitro študije. Po drugi strani pa E. acervulina v in vitro pogojih komajda raziskujejo. Dobro uveljavljen in pogosto uporabljen model in vitro za okužbo z E. tenella je govedo Madin Darbyledvicacelična linija (MDBK); vendar je malo znanega o primernosti celic MDBK kot gostiteljskih celic za E. acervulina. Enoplaste MDBK smo okužili z dvema različnima odmerkoma, 5 × 104 in 2 × 105, sporozoitov E. acervulina in ovrednotili kulture 24 in 96 ur po okužbi (hpi). Za primerjavo smo izvedli identičen test okužbe z uporabo sporozoitov E. tenella. Za oceno razmnoževanja parazitov je bilo s kvantitativno PCR v realnem času kvantificirano število kopij DNA markerja SCAR E. acervulina in gena ITS-1 E. tenella. Ugotovili smo, da se je število kopij E. acervulina znatno povečalo pri 24 hpi v primerjavi z E. tenella (p<0.05). after="" 96="" hpi,="" e.="" acervulina="" gene="" copies="" were="" considerably="" reduced="" while="" e.="" tenella="" continued="" to="" multiply=""><0.05). our="" results="" show="" that="" mdbk="" monolayers="" could="" be="" used="" for="" in vitro="" research="" aimed="" to="" study="" e.="" acervulina="" sporozoite="" cell="" invasion.="" nevertheless,="" modifications="" of="" in vitro="" cultivation="" appear="" necessary="" to="" allow="" qualitative="" and="" quantitative="" studies="" over="" longer="" periods="" of="" parasite="">

Ključne besede:Kokcidioza; Eimeria acervulina; Eimeria tenella; Perutnina; MDBK celice; Ledvica

CISTANCHE BO IZBOLJŠAL LEVIČNE/LEDVIČNE BOLEZNI

Uvod

Kokcidioza je gospodarsko pomembna bolezen v perutninski industriji (Blake et al. 2020). Bolezen povzročajo apikompleksni paraziti iz rodu Eimeria. Okužba se pojavi z oralnim zaužitjem sporuliranih oocist. Ko so v gostitelju, oociste sprostijo sporozoite, ki vdrejo v črevesne epitelne celice. Znotraj gostiteljskih celic so sporozoiti podvrženi ciklom nespolnega in spolnega razmnoževanja. Pri tem nastanejo oociste, ki se posledično izločijo z blatom. Pri okuženih živalih se lahko pojavi izguba teže, driska, nizka proizvodnja jajc, bolezen pa je lahko v nekaterih primerih smrtna (López-Osorio et al 2020). Sedem vrst Eimeria (E. acervulina, E. brunetti, E. maxima, E. mitis, E. necatrix, E. praecox in E. tenella) je odgovornih za aviarno kokcidiozo po vsem svetu. Morfologija oocist, patologija in resnost bolezni so pogosti dejavniki razlikovanja med temi vrstami. Od vseh sedmih Eimeria so E. acervulina, E. tenella in E. maxima najbolj razširjene na farmah za vzrejo brojlerjev (Jordan et al 2018; Moraes et al 2015; Györke et al 2013). Od teh treh vrst E. tenella velja za visoko patogeno, medtem ko E. acervulina in E. maxima kažeta zmerno patogenost (López-Osorio et al. 2020). Ne glede na razlike v patogenosti je zmerno patogena Eimeria spp. kot je E. acervulina, lahko med sočasno okužbo povečajo resnost bolezni (Hiob et al. 2017). Živalski modeli so dragocen element pri raziskavah okužb. Vendar lahko in vitro študije parazitov kokcidije prispevajo k osnovnemu razumevanju bolezni na celični ravni (Marugán-Hernández et al. 2020, Bussite et al. 2018, Thabet et al. 2017). Poleg tega so lahko koristno orodje, ki zagotavlja osnovne podatke za prihodnje terapije (Thabet et al. 2017; Khalafalla et al. 2011). Zaradi svoje sposobnosti rasti v neptičjih celičnih linijah (Marugán-Hernández et al. 2020; Thabet et al. 2017) se E. tenella pogosto uporablja kot modelni organizem v raziskavah in vitro (Marugán-Hernández et al. 2020). ; Thabet et al. 2019, 2017; Khalafalla et al. 2011) in veliko truda je bilo vloženega v raziskave E. tenella in vitro in in vivo, vključno z uporabo molekularnih pristopov, kot je kvantitativna PCR v realnem času (RT-qPCR). (Marugán-Hernández et al. 2020; Thabet et al. 2019, 2017; Hiob et al. 2017; Raj et al. 2013). Za druge vrste Eimeria, vključno z E. acervulina, so poročali o manj prizadevanjih (Naciri-Bontemps 1976; Itagaki et al. 1974; Strout et al. 1965; Hiob et al. 2017). Namen te študije je bil oceniti in vitro invazijo in replikacijo sporozoitov E. acervulina v monoslojih celic MDBK z uporabo kvantitativne PCR v realnem času.

CISTANCHE BO IZBOLJŠAL LEDVIČNO/LEDVIČNO DIALIZO

Materiali in metode

Prehajanje oocist E. acervulina in E. tenella OocisteE. acervulina in E. tenella so ločeno pasirali pri zdravih 11-dnevnih piščancih v skladu s spremenjeno metodo Eckerta et al. (1995). Sporulirane oociste smo zbrali in shranili v 4-odstotni raztopini kalijevega dikromata pri 4 stopinjah do nadaljnje uporabe.Čiščenje in ekscistacija oocistOociste obeh vrst Eimeria smo očistili iz 4-odstotne raztopine kalijevega dikromata. Nato smo sporozoite vzbudili in očistili v skladu s spremenjeno metodo, ki so jo opisali Rentería-Solís et al. (2020).Kultura celicMadin-Darby govedoledvica(MDBK) monoplasti (DSMZ, Braunschweig, Nemčija) so bili uporabljeni kot model okužbe. Celice MDBK smo zasejali (2 × 105 celic/jamico) v 24-plošče z vdolbinicami z Dulbeccovim modificiranim Eagleovim medijem (DMEM), dopolnjenim z 10 odstotki fetalnega govejega seruma (FBS), 100 i.e. penicilina, 100 ug/ml streptomicina in 2,5 ug/ml amfotericina in inkubirali pri 37 stopinjah v atmosferi s 5 odstotki CO2 v zraku, dokler niso dosegli 80 odstotkov konfluence.Okužba celic MDBK s sporozoiti EimeriaKonfluentne monosloje MDBK smo cepili s sporozoiti E. acervulina. Izvedene so bile predhodne študije, da bi izbrali odmerek za okužbo na podlagi različnih stopenj množice okužb (MOI) (parazit:celica): {{0}}.25, 0.5, 1.{ {9}}, 1,5 in 5.0 (Taha et al. neobjavljeni podatki). Za okužbo sta bila izbrana dva ločena odmerka: 5 × 104 (MOI: 0,25) ali 2 × 105 sporozoitov/vdolbinico (MOI: 0,5). Kulture, izpostavljene okužbi, smo nato inkubirali pri 41 stopinjah v mediju DMEM z 2 odstotki FBS, 100 i.e. penicilina, 100 ug/ml streptomicina in 2,5 ug/ml amfotericina. Izvedena sta bila dva različna časa inkubacije: 24 ur po okužbi (hpi) in 96 hpi. Za sporozoite E. tenella so izvedli enak nabor odmerkov okužbe in inkubacijskih časov. Vsi poskusi so vključevali eno negativno kontrolo, sestavljeno iz neokuženih monoslojev MDBK (NC-neokužene celice). Vsi testi so bili izvedeni v treh izvodih. Po 24 hpi smo celice trikrat sprali s sterilnim PBS (pH 7,2) in skupini s 96 hpi dodali nov medij, medtem ko smo kulture 24 hpi prekinili. Enosloji so bili tripsinizirani na koncu vsake inkubacijske dobe (24 hpi oziroma 96 hpi).

Ekstrakcija DNA in kvantitativna verižna reakcija s polimerazo v realnem času (RT-qPCR)DNK smo ekstrahirali iz tripsiniziranih celic z uporabo kompleta DNeasy Blood & Tissue (Qiagen, Hilden, Nemčija) v skladu s protokolom proizvajalca. RT-qPCR je bil izveden za kvantifikacijo kopij markerja Ac-R01-1731, značilnega za zaporedje pomnožene regije (SCAR) E. acervulina, in za notranji transkribirani distančnik 1 gena ribosomske DNA (ITS-1) E. tenella kot korelat razmnoževanja parazitov. Testi RT-qPCR so bili izvedeni v skladu z metodami, ki so jih opisali Blake et al. (2008) in Kawahara et al. (2008), z nekaterimi spremembami. Na kratko, reakcija volumna 20 µl je vsebovala 10 µl glavne mešanice SYBR Green® (Thermo Scientific, Dreieich, Nemčija), 500 nM začetnih in povratnih primerjev (tabela 1), 2 µl predloge DNA in 7 µl vode brez nukleaze. Vsakemu testu je bila dodana kontrola brez šablone (NTC), sestavljena iz vode brez nukleaze. Reakcije RT qPCR so bile pomnožene v trojnikih in izvedene na sistemu za odkrivanje PCR v realnem času Bio-Rad CFX Connect (Bio-Rad, Feldkirchen, Nemčija). Pogoji RT-qPCR so bili 95 stopinj 5 minut, čemur je sledilo 40 ciklov 95 stopinj 30 s. Žarjenje je bilo izvedeno pri 59,8 stopinjah in 58 stopinjah za 20 s za E. acervulina oziroma E. tenella, čemur je sledil en podaljšan cikel 20 s pri 72 stopinjah. Za ustvarjanje disociacijske krivulje je bil uporabljen program talilne krivulje, ki vključuje temperaturno območje od 60 do 95 stopinj. Končno sta bili standardni krivulji E. acervulina in E. tenella ustvarjeni s serijskim redčenjem genomske DNA oziroma serijskim redčenjem kloniranih genskih fragmentov ITS-1 (v skladu s Thabet et al. 2015).

Statistična analiza

D'Agostino-Pearson and Shapiro–Wilk normality tests were used to determine the normal distribution of data. A two-way ANOVA test was used for comparison of reproduction considering time points, infection doses, and Eimeria species. Differences were considered statistically significant when p>0.05. Vse statistične analize so bile narejene v programski opremi GraphPad Prism 9 (San Diego, CA, ZDA).

Rezultati in razprava

Genske kopije markerja SCAR E. acervulina in gena ITS-1 E. tenella so bile uspešno pomnožene in odkrite z RT-qPCR v vsaki reakciji. Po inkubacijski dobi 24 hpi je bilo število kopij, odkritih po aplikaciji odmerka 5 × 104 sporozoitov, bistveno višje (p=0.0002) za E. acervulina (1,88 × 105 ± 5,56 × 104 ) kot za E. tenella (3,60 × 104±5,37 × 103 ) (slika 1). Podobno je bilo pridobljeno bistveno večje (p=0.0002) število kopij za E. acervulina (4,82×105±8,50×104 ) kot za E. tenella (1,27×105±9,32×103 ) 24 hpi po nanos 2×105 sporozoitov (slika 1). V nasprotju s tem je bilo pri 96 hpi po okužbi s 5 × 104 sporozoitov število kopij v kulturah, okuženih z E. acervulina, znatno (p=0.0044) nižje (6,96 × 103 ± 3,87 × 103 ) v primerjavi z E. tenella (1,24 × 105 ± 1,01 × 105 ). Podobno je višji odmerek 2 × 105 sporozoitov, inkubiranih z enoslojnimi plastmi za daljše obdobje 96 hpi, povzročil znatno (p=0.0044) manjše količine kopij E. acervulina (3,35 × 104 ± 1,53 × 104 ) v primerjava z E. tenella (4,98×105±1,28×105 ) (slika 1).

Preizkusili smo sposobnost E. acervulina, da napade enoplastne sloje MDBK in se nato razmnoži preko 24 in 96 hpi. Prejšnji poskusi vrednotenja kulture E. acervulina so bili izvedeni s spremenljivimi rezultati. Strout et al. (1965) okužil različne primarne (piščančji zarodekledvicain fibroblasti) in stalne celične linije (mišji fibroblasti, celice HeLa). Strout et al. (1965) so poročali o prepoznavni celični okužbi pri 24 hpi v vseh celičnih linijah. Zanimivo je, da v nobenem od testiranih celičnih modelov niso opazili parazitske rasti v obdobjih, daljših od 24 hpi (Strout et al. 1965), kar je v skladu z našimi opazovanji padajočega števila genov.

kopije 96 hpi. Naciri-Bontemps (1976) je poročal o rasti E. acervulina pri piščancihledvicacelic do 93 hpi in opazili tvorbo oocist po inokulaciji merozoitov. Vendar, kolikor nam je znano, te ugotovitve niso bile potrjene s kasnejšimi publikacijami. Objavljen je bil le en članek o enoslojnih MDBK, okuženih s sporozoiti E. acervulina (Talebi 2001). Skratka, avtor je izpostavil celice MDBK, predhodno obdelane s hiperimunimi piščančjimi ali zajčjimi antiserumi, sporozoitom E. acervulina za 24 hpi. Kulture smo obarvali in znotrajcelične sporozoite mikroskopsko prešteli. Na žalost študija predstavlja samo odstotke inhibicije parazitov z antiserumom (Talebi 2001), zato zaključkov o učinkovitosti okužbe v tem modelu ni mogoče preprosto potegniti. Kolikor nam je znano, niso poročali o nadaljnjih poskusih uporabe celic MDBK kot modelov okužbe za E. acervulina. V skladu z ugotovitvami Strout et al. (1965) smo opazili največje razmnoževanje parazitov pri 24 hpi in izrazito zmanjšanje, ki je bilo kasneje predstavljeno z majhnim številom kopij pri 96 hpi. Strout et al. (1965) in Naciri-Bontemps (1976) sta poročala o kvalitativnih podatkih, ki izvirajo samo iz mikroskopske analize. Vendar pa je RT-qPCR bolj natančno in občutljivo sredstvo za oceno razmnoževanja parazitov. Pravzaprav se RT-qPCR danes običajno uporablja za kvantitativno vrednotenje in je bil uspešno uveljavljen za oceno razmnoževanja kokcidij (npr. Marugán-Hernández et al. 2020, Rentería Solís et al. 2020, Thabet et al. 2019, Bussiere et al. 2018, Hiob in drugi 2017, Thabet in drugi 2017, Raj in drugi 2013, Khalafalla in drugi 2011)

Vendar bi lahko elektronska mikroskopija zagotovila dragocene podatke za analizo znotrajceličnega razvoja E. acervulina v celicah MDBK. Zato je treba razmisliti o nadaljnjih in vitro preiskavah E. acervulina. Teoretično bi bile ptičje celične linije bolj primerne kot model okužbe in vitro za piščančje Eimeria, saj izvirajo iz naravnega gostitelja in bi lahko omogočile bolj reprezentativen vpogled v interakcije med parazitom in gostiteljem kot celične kulture, pridobljene iz sesalcev. Vendar pa je večina piščančjih celičnih kultur, primernih za raziskave kokcidioze perutnine, primarnih linij (Bussiere et al. 2018, Strout et al. 1965; Naciri-Bontemps 1976). Primarne celice imajo več omejitev v primerjavi s trajnimi kulturami. Ena je splošna potreba po svežem živalskem tkivu za začetek laboratorijskih poskusov, kar je lahko povezano s tveganjem kontaminacije (Verma et al. 2020). Poleg tega je treba za pridobitev primarnih celic živali žrtvovati, kar je v nasprotju z etičnimi vidiki. Končno je lahko standardizacija primarnih celičnih linij povezana s težavami.

CISTANCHE BO IZBOLJŠAL OKUŽBO LEDVIC/LEDVIC

Zato je uporaba ovekovečenih celičnih linij splošna praksa v večini raziskovalnih skupin, ki se ukvarjajo z in vitro kulturo ptičjih kokcidij. Na splošno so trajne kulture, pridobljene iz sesalcev, izbrane, ker so zlahka dostopne iz komercialnih virov in so vzpostavljena orodja, kot so protitelesa, markerji, objavljeni protokoli, genomska zaporedja itd., medtem ko to ne velja vedno za manj pogosto uporabljene piščančje celične linije . Celice MDBK so stalna linija, pridobljena iz goveda, ki se uporablja kot in vitro model za široko paleto aplikacij. Celice MDBK so dobro uveljavljene za in vitro študije E. tenella (Marugán-Hernández et al. 2020, Rentería-Solís et al. 2020, Thabet et al. 2019, Bussiere et al. 2018, Thabet et al. 2017, Khalafalla et al. drugi 2011). Marugán-Hernández et al. (2020) je na primer opravil obsežen opis znotrajceličnega razvoja E. tenella v celicah MDBK. V tej študiji so avtorji z RT-qPCR in PCR v realnem času z reverzno transkriptazo spremljali celično delitev in razvoj stopenj transgenih sevov E. tenella.

Naš cilj je bil kvantificirati razmnoževanje E. acervulina v celicah MDBK s tehnologijo PCR. Kolikor nam je trenutno znano, takšni podatki še niso bili objavljeni. Morfološke analize v našem poskusu nismo upoštevali. Vendar pa je bilo večkrat (Marugán-Hernández et al. 2020, Thabet et al. 2017 in Raj et al. 2013) dokazano, da je povečanje števila kopij genov dejansko povezano z razmnoževanjem med merogonijo. Razvoj po tej fazi nespolnega razmnoževanja je malo verjeten pod pogoji, podanimi v našem poskusu. Ugotovili smo, da v primerjavi z E. tenella sporozoiti E. acervulina napadejo celico in se v prvih 24 hpi množijo hitreje. Vendar se število genskih kopij znatno zmanjša za 96 hpi, kar kaže na dinamiko razmnoževanja parazitov za E. acervulina, ki se izrazito razlikuje od tiste za E. tenella. Tako se zdi verjetno, da se različne vrste Eimeria v kulturi in vitro obnašajo različno in da je treba splošne zaključke, pridobljene iz E. tenella kot edinega uveljavljenega modelnega organizma, sprejemati previdno. Dodatek več časovnih točk bi lahko bil koristen za podrobnejšo oceno dinamike razmnoževanja in vitro. Dodatne tehnike je mogoče uporabiti za pojasnitev dogajanja v tem obdobju in ali lahko iz teh rezultatov izhajajo praktične aplikacije za prihodnje terapije.

Kljub temu smo v tej celični liniji pokazali uspeh invazije parazitov. Zato bi lahko celice MDBK nadalje uporabili kot modele okužbe za invazijo celic sporozoitov E. acervulina. Priporočljiva je tudi uporaba RT-qPCR in drugih občutljivih orodij. Še pomembneje je, da ta celična linija podpira tudi okužbo z E. tenella. To bi lahko prevedli v primerjalne študije med obema vrstama Eimeria. Opraviti je treba nadaljnje podrobne kvantitativne in kvalitativne analize, da se oceni primernost kulture MDBK kot matrice in vitro za E. acervulina in razvojne stopnje drugih vrst piščancev Eimeria. pomoč; hvaležni smo tudi M. Fritscheju, B. Schneidewindu in R. Schumacherju (Inštitut za parazitologijo Univerze v Leipzigu) za njihovo odlično pomoč kot skrbniki živali. Najlepša hvala tudi R. Zhang (Koledž za živalske in veterinarske znanosti, Southwest Minzu University) za njeno dragoceno pomoč pri laboratorijskem delu. Avtorji se prav tako želijo zahvaliti R. Schmäschkeju (Inštitut za parazitologijo Univerze v Leipzigu) za njegovo dragoceno delo pri pripravi dovoljenj za živali.