Od ISG15-odvisne aktivacije senzorja MDA5 antagonizira SARS-CoV-2 papainu podobna proteaza, da se izogne ​​gostiteljevi prirojeni imunosti

Aktivacija receptorjev, podobnih RIG-I, gena I, inducibilnega z retinojsko kislino (RIG-I), in proteina 5, povezanega z diferenciacijo melanoma (MDA5), vzpostavi protivirusno stanje z uravnavanjem genov, stimuliranih z interferonom (IFN) (ISG). Med njimi je ISG15, katerega mehanične vloge v prirojeni imunosti še vedno ostajajo skrivnostne. V tej študiji poročamo, da je konjugacija ISG15 bistvena za protivirusne odzive IFN, ki jih posreduje senzor virusne RNA MDA5. ISGilacija aktivacijskih in rekrutacijskih domen kaspaze MDA5 spodbuja njegovo oligomerizacijo in s tem sproži aktivacijo prirojene imunosti proti vrsti virusov, vključno s koronavirusi, flavivirusi in pikornavirusi. Aktivacija MDA5, odvisna od ISG15-, je antagonizirana z neposredno de-ISGilacijo, ki jo posreduje papainu podobna proteaza SARS-CoV-2, nedavno pojavilega koronavirusa, ki je povzročil pandemijo COVID-19 . Naše delo dokazuje ključno vlogo ISG15 pri protivirusnem odzivu, ki ga posreduje MDA5-, in opredeljuje tudi ključni mehanizem imunske utaje SARS-CoV-2, ki je lahko cilj za razvoj novih protivirusnih zdravil in cepiv za boj proti COVID-19.

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

Kliknite tukaj za ogled izdelkov Cistanche Enhance Imunity

【Vprašajte za več】 E-pošta:cindy.xue@wecistanche.com/Whats App: 0086 18599088692/Wechat: 18599088692

Virusno motnjo imunske homeostaze gostitelja spremlja prirojeni imunski sistem, ki se opira na receptorje, ki zaznavajo molekularne vzorce, povezane z nevarnostjo ali patogenom (PAMP) 1–3. RIG-I podobni receptorji (RLR) RIG-I in MDA5 so ključni za odkrivanje virusa s pregledovanjem citoplazme za virusne ali gostiteljske imunostimulatorne RNA4. Vezava RNA na C-terminalno domeno (CTD) in helikazo RIG-I in MDA5 vodi v njuno signalno pripravljeno konformacijo, ki omogoča rekrutacijo več encimov5. Ti encimi spreminjajo RLR na več domenah in mestih, post-translacijske modifikacije (PTM) pa so še posebej dobro raziskane za domene za aktivacijo in rekrutiranje kaspaze (CARD), signalne module. Proteinska fosfataza 1 (PP1) / defosforilira RIG-I in MDA5 CARDs6. V primeru RIG-I defosforilacija spodbuja z Lys63-povezano poliubikvitinacijo CARD s TRIM25 (tripartitni motiv, ki vsebuje 25) in drugimi ligazami E37,8, kar stabilizira oligomerno obliko RIG-I in tako omogoči mitohondrijsko protivirusno -vezava na signalne beljakovine (MAVS). V primerjavi s tistimi iz RIG-I so posamezni koraki aktivacije MDA5 in vključeni kritični PTM slabše razumljeni. Aktivacija RLR inducira proizvodnjo IFN-jev tipa I in III, ki nato širijo protivirusno signalizacijo s povečano regulacijo ISG-jev9,10. Med njimi je ISG15, ubikvitinu podoben protein, ki ga je mogoče kovalentno konjugirati na lizinske ostanke ciljnih proteinov, proces PTM, imenovan ISGylation11. Čeprav je bilo splošno znano, da konjugacija ISG15 deluje protivirusno12, mehanizmi ISGilacije gostiteljskega proteina, ki bi lahko pojasnili široko protivirusno restrikcijsko aktivnost ISG15, trenutno niso znani. Povzročitelj sedanje pandemije COVID-19, koronavirus 2 hudega akutnega respiratornega sindroma (SCoV2), spada v družino Coronaviridae, ki vsebuje več drugih človeških patogenov. Koronavirusi imajo izjemno sposobnost zatiranja protivirusnih odzivov, ki jih posreduje IFN, nizka proizvodnja IFN pri bolnikih, okuženih s SCoV2-, pa je povezana s hudo boleznijo13. Med antagonisti koronavirusnega IFN je papainu podobna proteaza (PLpro), ki ima deubikvitinacijsko in de-ISGilacijsko aktivnost14,15. V tej študiji ugotavljamo bistveno vlogo ISGilacije pri aktivaciji MDA5. Nadalje smo pokazali, da SCoV2 PLpro sodeluje z MDA5 in antagonizira ISG15-odvisno aktivacijo MDA5 prek aktivne de-ISGilacije, kar razkriva, da se je SCoV2 že razvil, da bi ušel imunskemu nadzoru z MDA5.

Rezultati

MDA5, vendar ne RIG-I, signalizacija zahteva ISG15.

Za identifikacijo PTM-jev MDA5 CARD, ki lahko uravnavajo aktivacijo MDA5, smo afinitetno očiščen MDA5–2CARD, spojen z glutation-S-transferazo (GST–MDA5–2CARD), ali samo GST, izpostavili tekočinski kromatografiji v kombinaciji s tandemsko masno spektrometrijo (LC –MS/MS) in ugotovil, da je GST–MDA5–2CARD soočiščen z ISG15, ki sta se pojavila kot dva pasova, ki sta migrirala počasneje (za ~15 in 30 kDa) kot nespremenjeni GST–MDA5–2CARD (razširjeni podatki Slika 1a). Imunobloting (IB) je potrdil, da je GST–MDA5–2CARD spremenjen z ISG15 (razširjeni podatki, slika 1b). Nato smo ugotovili pomembnost ISG15 za signalizacijo, ki jo povzroči MDA5-. Medtem ko je izražanje FLAG–MDA5 v mišjih embrionalnih fibroblastih (MEF) divjega tipa (WT) induciralo IFN-messenger RNA in beljakovine ter transkripte Ccl5 na način, odvisen od odmerka, je izražanje FLAG–MDA5 v Isg15−/− MEF povzročilo ablacijo protivirusni gen in izražanje beljakovin (slika 1a in razširjeni podatki, slika 1c). Podobno se je indukcija protivirusnega gena močno zmanjšala v ISG15 knockout (KO) HeLa (človeških) celicah v primerjavi s kontrolnimi celicami WT (slika 1b in razširjeni podatki, slika 1d), kar je izključilo učinek, specifičen za vrsto. V nasprotju s tem je FLAG-RIG-I induciral primerljive količine izločenega IFN-proteina kot tudi transkriptov Ifnb1 in Ccl5 v Isg15-/- in WT MEF (slika 1a in razširjeni podatki, slika 1c). Transkripti IFNB1 in CCL5 ter proizvodnja beljakovin IFN s FLAG–RIG-I so bili podobni ali rahlo povečani v celicah ISG15 KO HeLa v primerjavi s celicami WT (slika 1b in razširjeni podatki, slika 1d), kar je skladno s prejšnjimi poročili, da je ISGilacija negativno vpliva na signalizacijo RIG-I16,17

Slika 1|ISGilacija je potrebna za signalizacijo MDA5, ne pa RIG-I. a,b, ELISA IFN- iz supernatantov MEF (WT ali Isg15−/−) (a) in celic HeLa (WT ali ISG15 KO) (b), začasno transficiranih z naraščajočimi količinami FLAG-označenega MDA5 ali RIG-I za 40 h. Celocelične lizate (WCL) je IB testiral z anti-ISG15, anti-FLAG in anti-aktinom (kontrola obremenitve). c, ELISA IFN- iz supernatantov WT ali Isg15-/- MEF, ki so bili lažno stimulirani ali transficirani z EMCV RNA (0.1 ali 0.4 µg ml-1), HMW-poli (I: C) (0,5 µg ml−1 ) ali RABVLe (1 pmol ml−1 ) ali okuženi s SeV (10 hemaglutinacijskih enot (HAU) ml−1 ) za 24 h. d, analiza RT-qPCR mRNA Ifnb1, Ccl5 in Tnf v WT in Isg15-/- MEF, stimuliranih kot v c. e, fosforilacija IRF3 v WCL NHLF, ki so bile 30 ur transfektirane z navedenimi siRNA in nato 6 ur lažno stimulirane ali transficirane z EMCV RNA (0,4 µg ml-1) ali RABVLe (1 pmol ml-1), ocenjeno z IB z anti-pSer396-IRF3 in anti-IRF3. f, ELISA IFN- iz supernatantov NHLF, ki so bili 30 ur transficirani z navedenimi siRNA in nato lažno stimulirani ali transficirani z EMCV RNA (0,4 µg ml-1) ali RABVLe (1 pmol ml-1) ali okuženi s SeV (10 HAU ml-1 ) 16 ur. g, ELISA IFN- iz supernatantov PBMC, ki so bili 40 ur transducirani z navedenimi lentivirusnimi delci shRNA in nato okuženi z mutEMCV (MOI=10) ali SeV (200 HAU ml-1 ) 8 ur. h, RT-qPCR analiza IFNA2 in IL-6 mRNA v PBMC, ki so bili transducirani in okuženi kot v g. Podatki predstavljajo vsaj dva neodvisna poskusa s podobnimi rezultati (povprečje ± sd n= 3 bioloških ponovitev v a–d in f ter povprečje n= 2 bioloških ponovitev v g in h). *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test). ND, not detected; NS, not significant.

Nato smo preizkusili učinek delecije gena ISG15 na aktivacijo endogenih MDA5 in RIG-I z njihovimi ustreznimi ligandi. Proizvodnja IFN ter ekspresija genov IFNB1, CCL5 in TNF, povzročena s transfekcijo RNK virusa encefalomiokarditisa (EMCV) ali visokomolekularne (HMW)-poli(I:C), oba pa pretežno zaznava MDA5, so bile v celicah Isg15−/− MEF, ISG15 KO HeLa in ISG15 KO HAP-1 močno oslabljene v primerjavi z njihovimi kontrolnimi celicami (sl. 1c, d in razširjeni podatki, sl. 1e–g). Pomembno je, da ablacija indukcije protivirusnega gena z EMCV RNA ali HMW-poly(I: C) v celicah ISG15 KO ni bila posledica preklicane ekspresije gena MDA5; nasprotno, ekspresija mRNA MDA5 je bila povečana v celicah ISG15 KO v primerjavi s celicami WT (razširjeni podatki, slika 1f, g). V nasprotju s stimulacijo z agonisti MDA5 je stimulacija celic Isg15−/− MEF in ISG15 KO HeLa s transfekcijo vodilne RNA virusa stekline (RABVLe) ali okužbo z virusom Sendai (SeV), ki sta dražljaja RIG-I, povzročila proizvodnjo IFN in izražanje protivirusnega gena, primerljivo s celicami WT (sl. 1c, d in razširjeni podatki, sl. 1e). Da bi izključili morebitne klonske učinke, ki bi jih lahko povezali s celicami, izbrisanimi z genom ISG15, smo izvedli poskuse prehodnega utišanja genov v primarnih normalnih človeških pljučnih fibroblastih (NHLF). Utišanje ISG15, podobno knockdownu MDA5, je privedlo do skoraj popolne izgube fosforilacije IFN-regulacijskega faktorja 3 (IRF3) – značilnega znaka aktivacije RLR-signala – po stimulaciji z EMCV RNA, ne pa tudi do RABVLe izpuščene produkcije IFN in izražanje protivirusnega transkripta v NHLF, transficiranih z EMCV RNA, vendar ne v celicah, stimuliranih z RABVLe ali SeV (slika 1f in razširjeni podatki, slika 1h). Utišanje ISG15 ali MDA5 v primarnih človeških mononuklearnih celicah periferne krvi (PBMC), posredovano z majhno lasno (sh)RNA, je prav tako znatno zmanjšalo izražanje protivirusnih beljakovin in transkriptov po okužbi z rekombinantnim mutantnim EMCV (mutEMCV) s pomanjkanjem antagonizma MDA518,19 v primerjavi z okužene PBMC, transducirane z neciljno kontrolno shRNA (sl. 1g, h in razširjeni podatki, sl. 1i). Nasprotno pa izčrpavanje ISG15 ali MDA5 ni vplivalo na odzive citokinov v PBMC po okužbi s SeV (sl. 1g, h in razširjeni podatki, sl. 1i). Ti rezultati kažejo, da je ISG15 bistven za imunsko signalizacijo z MDA5, ne pa tudi z RIG-I. Kartice MDA5 so ISGilirane pri Lys23 in Lys43.

koristi cistanche za moške - krepitev imunskega sistema

Da bi potrdili našo analizo MS, ki je identificirala ISGilacijo MDA5–2CARD, smo najprej preizkusili, ali je endogeni MDA5 modificiran tudi z ISG15. Endogeni MDA5 je bil močno ISGiliran v celicah, transficiranih s HMW-poly(I:C) ali okuženih z virusoma denge (DENV) ali Zika (ZIKV), ki jih zazna MDA5 (ref. 5) (slika 2a). Predvsem je bil endogeni MDA5 tudi ISGiliran v neokuženih celicah, čeprav na zelo nizkih ravneh (razširjeni podatki, slika 2a), kar je skladno s prejšnjimi ugotovitvami, da so številni gostiteljski proteini tudi ISGilirani na nizkih ravneh v normalnih (neokuženih) pogojih20. V celicah, zdravljenih z anti-IFNAR2 za blokiranje regulacije ISG, posredovane s signalizacijo IFNAR, je utišanje ISG15 ali MDA5 povzročilo primerljivo zmanjšanje izražanja gena IFNB1 po okužbi z mutEMCV (razširjeni podatki, slika 2b), kar kaže, da je ISG15-odvisen Signalizacija MDA5 se pojavi tudi v odsotnosti signalizacije IFNAR.

t MDA5Δ2CARD (ki vsebuje helikazo in CTD) je primarno mesto MDA5 ISGilacije, ki prikazuje dva vidna pasova za ISGilirani 2CARD (slika 2b). Rekonstitucija celic ISG15 KO HeLa z WT ISG15 ali mutantom ISG15, ki ga ni mogoče konjugirati, v katerem sta bila dva glicina, potrebna za konjugacijo, nadomeščena z alaninom (ISG15-AA)21, je pokazala kovalentno konjugacijo ISG15 (slika 2c) . Mutacija posameznih lizinskih ostankov v GST–MDA5–2CARD v arginin je pokazala, da je mutacija na enem mestu Lys23 in Lys43 opazno zmanjšala ISGilacijo (razširjeni podatki, slika 2c), medtem ko je njuna kombinirana mutacija (Lys23Arg/Lys43Arg) skoraj odpravila ISGilacijo (slika 2d). ). Celotna dolžina FLAG–MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg je prav tako pokazala izrazito zmanjšano ISGilacijo (slika 2e in razširjeni podatki, slika 2d); preostala ISGilacija, opažena pri FLAG–MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg, je verjetno posledica dodatnih manjših mest v 2CARD in/ali Δ2CARD. Omeniti velja, da mutacija Lys23Arg/Lys43Arg ni vplivala na SUMOilacijo MDA5–2CARD5 (razširjeni podatki, slika 2e). Poleg tega, medtem ko je bil RIG-I–2CARD močno ubikvitiniran (kar predstavlja kovalentno Lys63-povezano ubikvitinacijo7), niti MDA5–2CARD WT niti Lys23Arg/Lys43Arg mutant nista pokazala zaznavnih ravni ubikvitinacije (razširjeni podatki, slika 2f). Skupaj ti rezultati kažejo, da so kartice MDA5 CARD podvržene ISGilaciji na dveh glavnih mestih, Lys23 in Lys43.

CARD ISGylation je potrebna za aktivacijo MDA5.

Če primerjamo njihovo sposobnost prenosa signala, sta mutanta MDA5–2CARD Lys23Arg in Lys43Arg na enem mestu pokazala delno zmanjšano aktivacijo promotorja IFN v primerjavi z WT MDA5–2CARD, medtem ko je imel mutant Lys23Arg/Lys43Arg močno zmanjšano signalno aktivnost, ki je bila skoraj enako močna kot pri signalno okvarjenih mutantih Ser88Glu in Ser88Asp6 (razširjeni podatki, slika 2g). V nasprotju s tem je mutant, pri katerem je bil Lys68, ki je ostanek lizina, ki je najbolj proksimalen Lys43 in Lys23, nadomeščen z argininom (Lys68Arg), pokazal primerljivo konjugacijo ISG15 in sposobnost signaliziranja z WT 2CARD (razširjeni podatki, slika 2c, g). MDA5–2CARD Lys23Arg/Lys43Arg v nasprotju z WT MDA5–2CARD tudi ni uspel inducirati dimerizacije IRF3 (razširjeni podatki, slika 2h). FLAG-MDA5 Lys23Arg, Lys43Arg ali Lys23Arg/Lys43Arg je prav tako pokazal zmanjšane ali skoraj odpravljene sposobnosti aktiviranja promotorja IFN v primerjavi s FLAG-MDA5 WT (slika 2f). MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg je pokazal globoko signalno napako, tudi če je bil izražen v velikih količinah, medtem ko je WT MDA5 induciral protivirusne transkripte na način, ki je odvisen od odmerka (slika 2g). Strinjamo se, fosforilacijo STAT1, značilnost signalizacije IFNAR, kot tudi ekspresijo proteina ISG močno inducira MDA5 WT, ne pa Lys23Arg/Lys43Arg (slika 2h). Komplementacija MDA5-gensko urejenih človeških astrocitov (SVGA) z MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg ali Ser88Glu je povzročila močno zmanjšanje transkriptov IFNB1, CCL5 in ISG v primerjavi s celicami, ki izražajo WT MDA5 (slika 2i in razširjeni podatki, slika 2i) . Ti rezultati kažejo, da je ISGilacija pri Lys23 in Lys43 bistvena za citokinske odzive, ki jih posreduje MDA5-.

koristi cistanche za moške - krepitev imunskega sistema

Defosforilacija s PP1 uravnava MDA5 ISGilacijo.

Podobno kot RIG-I je MDA5 fosforiliran znotraj CARD v neokuženih celicah, kar preprečuje samoaktivacijo; defosforilacija RIG-I in MDA5 s PP1 / je ključnega pomena za sprostitev RLR iz njihovih signalno potlačenih stanj 6, 22–24. Defosforilacija RIG-I omogoča Lys63-povezano vseprisotnost CARD, kar spodbuja multimerizacijo in signalizacijo RIG-I5. Podrobnosti o tem, kako defosforilacija CARD (pri Ser88) sproži aktivacijo MDA5, so ostale nedosegljive, zato smo testirali, ali defosforilacija uravnava MDA5 ISGilacijo. Utišanje PP1 / močno zmanjšana ISGilacija MDA5–2CARD (razširjeni podatki, slika 3a). Poleg tega sta fosfomimetična mutanta Ser88Glu in Ser88Asp zmanjšala ISGilacijo, medtem ko je fosfon-nič mutant Ser88Ala pokazal močnejšo ISGilacijo kot WT MDA5–2CARD (razširjeni podatki, slika 3b). Nasprotno pa sta imela MDA5 WT in Lys23Arg/Lys43Arg primerljivo fosforilacijo Ser88 (razširjeni podatki, slika 3c). Ti podatki skupaj kažejo, da je defosforilacija MDA5 pri Ser88 pred ISGilacijo CARD. Nato smo uporabili protein V virusa ošpic (MeV-V), ki antagonizira defosforilacijo MDA5 Ser88 prek PP1 / antagonizma25. Ekspresija MeV-V je povečala fosforilacijo Ser88 (ki kaže na ablirano defosforilacijo) GST-MDA5-2CARD ali FLAG-MDA5 na način, odvisen od odmerka, kot je bilo prikazano prej . Izboljšana fosforilacija z MeV-V je povezana z upadom ISGilacije (razširjeni podatki, slika 3d,e). V nasprotju z WT MeV-V je mutirani MeV-V, ki je odpravil vezavo PP1-in MDA5-defosforilacijski antagonizem (MeV-VΔtail)25, pokazal majhen učinek na ISGilacijo MDA5–2CARD (Razširjeni podatki Slika 3f), krepitev inhibicije ISGilacije je predvsem posledica inhibicije PP1 in ne drugih antagonističnih učinkov z MeV-V. Proteini V iz virusov Nipah in Hendra (NiV-V in HeV-V) so prav tako povečali fosforilacijo MDA5 Ser88 in ustrezno dušili ISGilacijo MDA5 (razširjeni podatki, slika 3g,h), kar kaže, da več paramiksovirusnih V proteinov zavira ISGilacijo MDA5 z manipulacijo fosforilacije Ser88, čeprav je treba natančne mehanizme za posamezne proteine ​​V še določiti. Ti podatki skupaj kažejo, da je ISGilacija MDA5 CARD odvisna od defosforilacije pri Ser88.

ISGylation spodbuja sklope MDA5 višjega reda.

Aktivacija RLR zahteva vezavo RNA, oligomerizacijo RLR in njihovo translokacijo iz citosola v mitohondrije za interakcijo z MAVS5. Da bi razjasnili mehanizem, s katerim ISGylation vpliva na aktivnost MDA5, smo najprej preučili, ali ISGylation vpliva na vezavo RNA. Endogeni MDA5, prečiščen iz WT ali Isg15-/- MEF, je enako dobro deloval s HMW-poli (I: C) in vitro (razširjeni podatki, slika 4a). MDA5 WT in Lys23Arg/Lys43Arg sta pokazala primerljivo vezavo na HMW-poli (I: C), kar kaže, da ISGilacija ne vpliva na sposobnost vezave MDA5 na RNA (razširjeni podatki, slika 4b). Ko smo spremljali translokacijo MDA5 iz citosola v mitohondrije po stimulaciji EMCV RNA, smo ugotovili, da je utišanje ISG15, ne pa tudi transfekcija C, odpravilo translokacijo MDA5 (slika 3a). Nasprotno pa je bila translokacija RIG-I po transfekciji RABVLe učinkovita tako pri osiromašenem ISG15- kot pri si. C-transficirane celice (slika 3b). Ti podatki so pokazali, da ISGylation uravnava translokacijo MDA5 ali korak pred njo. Ker translokacija MDA5 iz citosola v mitohondrije zahteva interakcijo z 14-3-3η26, smo primerjali 14-3-3η vezavo WT in mutantnega MDA5. Sposobnost MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg, da veže 14-3-3η, je bila podobna sposobnosti WT MDA5 ali mutanta Lys68Arg (razširjeni podatki, slika 4c). Medtem ko je stimulacija EMCV RNK učinkovito inducirala oligomerizacijo MDA5 v WT MEF, je bila tvorba oligomerov MDA5 ablirana pri MEF s pomanjkanjem ISG15- (slika 3c). Podrtje ISG15 v celicah 293T je tudi odpravilo oligomerizacijo FLAG-MDA5-2CARD (slika 3d). Nasprotno pa je sočasna ekspresija komponent stroja ISGylation, Ube1L in UbcH8, močno izboljšala oligomerizacijo MDA5–2CARD v si. C-transfektirane celice, vendar ne v celicah, osiromašenih z ISG15- (slika 3d), kar kaže, da je za tvorbo oligomera MDA5 potrebna ISGilacija. V podporo temu konceptu je FLAG–MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg pokazal skoraj odpravljeno oligomerizacijo, medtem ko se je WT MDA5 učinkovito oligomeriziral (slika 3e). Primerjali smo tudi učinek mutacije Lys23 Arg/Lys43Arg z mutacijami, ki motijo ​​oligomerizacijo, ki se lokalizirajo na vmesnik med monomeri MDA5 in ovirajo filamentacijo MDA5, posredovano z vezavo RNA (Ile841Arg/Glu842Arg in Asp848Ala/Phe849Ala) 27, 28, ali na CARD (Gly74Ala/Trp75Ala) in motijo ​​oligomerizacijo 2CARD27. Za razliko od WT MDA5 je mutant Lys23Arg/Lys43Arg, podoben MDA5 Gly74Ala/Trp75Ala, pokazal pomanjkljivo oligomerizacijo in, v skladu s tem, odpravil sposobnost aktivacije promotorja IFN (sl. 3f, g). Uvedba Lys23Arg/Lys43Arg v ozadje Ile841Arg/Glu842Arg ali Asp848Ala/Phe849Ala, ki sta sama po sebi zmanjšala oligomerizacijo in signalizacijo MDA5, je tudi odpravila tvorbo oligomera MDA5 in indukcijo IFN (sl. 3f, g). Ker LGP2 olajša nukleacijo MDA5 na dvoverižni RNA in s tem oligomerizacijo MDA5 29, 30, smo primerjali vezavo LGP2 MDA5 WT in Lys23Arg/Lys43Arg. MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg je medsebojno deloval z LGP2 tako učinkovito kot WT MDA5 (razširjeni podatki, slika 4d), kar je okrepilo predlog, da CARD ISGylation spodbuja oligomerizacijo MDA5 neodvisno od filamentacije, posredovane z vezavo RNA. Skupaj ti rezultati dokazujejo, da ISGylation olajša oligomerizacijo CARD in sklope MDA5 višjega reda.

Slika 2|Aktivacija MDA5 zahteva ISGilacijo na Lys23 in Lys43. endogena MDA5 ISGilacija v NHLF, ki so bili lažno zdravljeni, transficirani s HMW-poly(I: C) (0.1 µg ml-1 ) 40 ur (levo) ali okuženi z DENV ali ZIKV (MOI {{ 10}} za vsakega) 48 ur (desno), določeno z IP z anti-MDA5 (ali kontrolo izotipa IgG) in IB z anti-ISG15. b, ISGilacija FLAG-označenih MDA5–2CARD in MDA5Δ2CARD v prehodno transfektiranih celicah HEK293T, ki so prav tako izražale V5–ISG15, HA–Ube1L in FLAG–UbcH8, ocenjeno s FLAG PD in IB z anti-V5 40 ur po transfekciji. c, endogena ISGilacija MDA5 v celicah ISG15 KO HeLa, stabilno rekonstituiranih z vektorjem, WT ISG15 ali ISG15-AA in sotransficiranih s HA–Ube1L in FLAG–UbcH8 po zdravljenju z IFN (1,000 U ml-1) 24 ur, določeno z IP z anti-MDA5 in IB z anti-ISG15. d, ISGilacija GST–MDA5–2CARD WT in Lys23Arg/Lys43Arg v celicah HEK293T, ki so bile sočasno transficirane z V5–ISG15, HA–Ube1L in FLAG–UbcH8 24 ur, določeno z GST PD in IB z anti-V5. e, ISGilacija FLAG–MDA5 WT in Lys23Arg/Lys43Arg v celicah HEK293T, ki so bile sočasno transficirane z V5–ISG15, HA–Ube1L in FLAG–UbcH8, določeno s FLAG PD in IB z anti-V5. f, aktivnost reporterja IFN-luciferaze v celicah HEK293T, ki so bile 40 ur transfektirane z vektorjem, FLAG-MDA5 WT ali mutanti. Vrednosti luciferaze so predstavljene kot kratna indukcija glede na vrednosti za celice, transficirane z vektorji, nastavljene na 1. WCL so bile testirane z IB z anti-FLAG in anti-actin. g, analiza RT-qPCR mRNA IFNB1 in CCL5 v celicah HEK293T, ki so bile začasno transficirane bodisi z vektorjem bodisi z naraščajočimi količinami FLAG-MDA5 WT ali Lys23Arg/Lys43Arg. h, fosforilacija STAT1 in številčnost beljakovin ISG (IFIT1 in -2) v WCL celic HEK293T, ki so bile začasno transficirane z vektorjem ali FLAG-MDA5 WT ali Lys23Arg/Lys43Arg, določeno z IB. I, RT-qPCR analiza navedenih protivirusnih genov v MDA5 KO SVGA, ki so bili začasno rekonstituirani bodisi s praznim vektorjem bodisi s FLAG označenim MDA5 WT, Lys23Arg/Lys43Arg ali Ser88Glu. Podatki predstavljajo vsaj dva neodvisna poskusa s podobnimi rezultati (srednja vrednost ± sd n= 3 bioloških ponovitev v f, g in i). *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).

Slika 3|CARD ISGylation spodbuja tvorbo sklopov MDA5 višjega reda. a,b, citosolno-mitohondrijsko frakcioniranje WCL iz NHLF, ki so bili 30 h transfektirani z netarčno kontrolno siRNA (si. C) ali ISG15-specifično siRNA (si.ISG15) in nato lažno obdelani ali transfektirani z EMCV RNA (0,4 µg ml-1 ) (a) ali RABVLe (1 pmol ml-1 ) (b) 16 ur. IB je bil izveden z anti-MDA5 (a), anti-RIG-I (b), anti-ISG15 in anti-aktinom (a in b). -Tubulin in MAVS sta služila kot označevalca čistosti za citosolno oziroma mitohondrijsko frakcijo (a in b). c, endogena oligomerizacija MDA5 v WT in Isg15-/- MEF, ki so bili transfektirani z EMCV RNA (0,5 µg ml-1) 16 ur in ocenjeni s SDD-AGE in IB z anti-MDA5. WCL so nadalje analizirali s SDS-PAGE in testirali z IB z anti-MDA5 in anti-aktinom. d, Oligomerizacija FLAG-MDA5-2CARD v celicah HEK293T, ki so bile transficirane z navedenimi siRNA, bodisi z ali brez HA-Ube1L in FLAG-UbcH8 48 ur, določeno z NativePAGE in IB z anti-FLAG. WCL so nadalje analizirali s SDS-PAGE in testirali z IB z anti-FLAG, anti-HA, anti-ISG15 in anti-actin. e, Oligomerizacija FLAG–MDA5 WT in Lys23Arg/Lys43Arg v prehodno transfektiranih celicah MDA5 KO HEK293, ocenjena s SDD–AGE in IB z anti-FLAG. WCL so nadalje analizirali s SDS-PAGE in IB z anti-FLAG in anti-actin. f, Oligomerizacija FLAG-označenega MDA5 WT in mutantov v prehodno transfektiranih celicah MDA5 KO HEK293, ocenjenih z NativePAGE in IB z anti-MDA5. WCL so nadalje analizirali s SDS-PAGE in testirali z IB z anti-MDA5 in anti-aktinom. g, aktivnost reporterja IFN-luciferaze v celicah MDA5 KO HEK293, ki so bile 24 ur transfektirane bodisi s praznim vektorjem bodisi s FLAG-označenim MDA5 WT ali mutanti. Aktivnost luciferaze je predstavljena kot kratna indukcija glede na vrednosti za vektorsko transficirane celice, nastavljene na 1. Podatki predstavljajo vsaj dva neodvisna poskusa s podobnimi rezultati (povprečje ± sd n= 3 bioloških ponovitev v g). ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).

Signalizacija MDA5, odvisna od ISGilacije, omejuje razmnoževanje virusa.

Nato smo ocenili, ali je ISGilacija MDA5 potrebna za njegovo sposobnost omejevanja replikacije virusa. FLAG–MDA5 WT, vendar ne Lys23Arg/Lys43Arg, je močno (za ~2log) zaviral replikacijo EMCV (slika 4a). Podobno so celice MDA5 KO HEK293, rekonstituirane z WT MDA5, vendar ne celice, dopolnjene z mutantom Lys23Arg/Lys43Arg, učinkovito omejile replikacijo DENV (slika 4b). Rekonstituirali smo tudi SVGA astrocitov MDA5 KO, fiziološko pomembno celično vrsto za okužbo z ZIKV, z vektorjem ali MDA5 WT ali Lys23Arg/Lys43Arg, nato pa ocenili replikacijo ZIKV v 40-h časovnem poteku. Replikacija ZIKV je bila oslabljena za ~100--krat v celicah, rekonstituiranih z WT MDA5, v primerjavi s celicami, ki izražajo vektor. Nasprotno pa celice, dopolnjene z MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg, niso omejile ZIKV, podobno kot celice, ki izražajo MDA5 Ser88Glu (slika 4c). WT MDA5, vendar ne Lys23Arg/Lys43Arg, je prav tako omejil replikacijo SCoV2, čeprav v manjšem obsegu kot pri drugih testiranih virusih (slika 4d).

Slika 4|ISGilacija je potrebna za virusno restrikcijo z MDA5. Titri EMCV v supernatantu celic HEK293T, ki so bile 40 h transfektirane z bodisi vektorjem bodisi FLAG–MDA5 WT ali Lys23Arg/Lys43Arg in nato okužene z EMCV (MOI=0.001) 24 h, določeno s testom TCID50. b, Odstotek celic MDA5 KO HEK293, okuženih z DENV, ki so bile 24 ur transfektirane z vektorjem ali FLAG–MDA5 WT ali Lys23Arg/Lys43Arg, nato pa lažno zdravljene ali okužene z DENV (MOI=5) 48 ur , ocenil FACS z uporabo anti-flavivirusa E (4G2). SSC, stranski razpršilec. c, titri ZIKV v supernatantu MDA5 KO SVGA, ki so bili 30 ur transfektirani z vektorjem ali FLAG-označenim MDA5 WT, Lys23Arg/Lys43Arg ali Ser88Glu in nato okuženi z ZIKV (MOI=0.1) za navedene čase , določeno s testom plakov. pfu, enote za tvorbo plakov; hpi, ure po okužbi. d, titri SCoV2 v supernatantu celic HEK293T–hACE2, ki so bile 24 ur transfektirane s praznim vektorjem ali FLAG–MDA5 WT ali Lys23Arg/Lys43Arg in nato okužene s SCoV2 (MOI=0.5) 24 ur h, določeno s testom plakov. e, Shema eksperimentalnega pristopa za 'ločevanje' vloge ISG15 pri MDA5-posredovani indukciji IFN od njegove vloge pri dušenju signalizacije IFNAR. Sup., supernatant. f, NHLF 'donorske' celice so bile 40 ur transfektirane z navedenimi siRNA in nato 16 ur okužene z mutEMCV (MOI=0.1). Celični supernatanti so bili UV-inaktivirani in preneseni na 'prejemne' celice Vero. Po 24 urah so bile celice okužene z ZIKV (MOI=0.002–2) za 72 ur in ZIKV-pozitivne celice so bile določene z imunskim barvanjem z anti-flavivirusom E (4G2) in substratom peroksidaze TrueBlue. g, RIG-I KO HEK293 'donorske' celice so bile transficirane s si. C ali si.ISG15 skupaj z vektorjem ali FLAG–MDA5 WT ali Lys23Arg/Lys43Arg 24 ur, čemur je sledila okužba z EMCV (MOI=0.001) 16 ur. UV-inaktivirane celične supernatante smo za 24 ur prenesli na 'prejemne' celice Vero, čemur je sledila okužba z EMCV (MOI=0.001–0.1) za 40 ur. Citopatske učinke, ki jih povzroči EMCV, so vizualizirali z barvanjem s Coomassie Blue. Podatki predstavljajo vsaj dva neodvisna poskusa s podobnimi rezultati (srednja vrednost ± sd od n= 3 bioloških ponovitev v a–d). *P< 0.05, **P< 0.01 (two-tailed, unpaired Student's t-test).

Nato smo določili učinek utišanja ISG15 na sposobnost MDA5, da zavira replikacijo virusa. Čeprav MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg ni uspel zatreti replikacije EMCV ne glede na utišanje ISG15, je WT MDA5 učinkovito omejil replikacijo EMCV v si. C-transfektirane celice in, nepričakovano, tudi v celicah, osiromašenih z ISG15- (razširjeni podatki, slika 5a). Pri raziskovanju osnovnega mehanizma teh nepričakovanih rezultatov smo ugotovili, da so imele celice, okužene z EMCV, ki so izražale WT MDA5, izrazito povečane ravni izražanja proteina ISG, ko je bil ISG15 utišan, v primerjavi z okuženimi celicami, transficiranimi z WT MDA5 in si. C (razširjeni podatki, slika 5b). Podobno so opazili povečan transkript ISG in izražanje beljakovin v celicah s pomanjkanjem ISG15-, ki so bile transficirane z EMCV RNA ali okužene z mutEMCV, kljub prekinitvi indukcije IFN (razširjeni podatki, slika 5c,d). V nasprotju s tem je knockdown MDA5 razveljavil ekspresijo beljakovin IFN in ISG, kot je bilo pričakovano (razširjeni podatki, slika 5d). Opazili smo, da se je številčnost beljakovin USP18, deubikvitinacijskega encima, ki negativno uravnava signalizacijo IFNAR31, močno zmanjšala v celicah, osiromašenih z ISG15-, po okužbi z EMCV v primerjavi z okuženimi celicami, ki so bile transfektirane s si. C ali MDA5-specifična siRNA (razširjeni podatki, slika 5b,d), kar je skladno s poročano vlogo ISG15 pri preprečevanju razgradnje USP1832. Ti podatki skupaj kažejo, da je v eksperimentalnih nastavitvah ciljanja na gen ISG15- (to je utišanje ali KO) protivirusni učinek ISGilacije MDA5 prikrit z nenormalno regulacijo ISG zaradi ablacije zaviralnega učinka ISG15 na signalizacijo IFNAR.

Slika 5|SCoV2 PLpro se veže na in de-ISGilira MDA5–2CARD. trakasta predstavitev kristalne strukture kompleksa SCoV2 PLpro: ISG15 (banka podatkov o beljakovinah, pristopna št. 6YVA). Navedeni so ključni ostanki, ki posredujejo interakcijo na mestu 1 (Asn156 in Arg166/Glu167) ali interakcijo na mestu 2 (Phe69) v PLpro, kot tudi njegovo katalitično aktivno mesto (Cys111). b, ISGilacija GST–MDA5–2CARD v celicah HEK293T, ki so bile 20 ur sotransfektirane z vektorjem ali V5-označenim SCoV2 PLpro WT ali mutanti, skupaj s FLAG–ISG15, HA–Ube1L in FLAG–UbcH8, določen z GST PD in IB z anti-FLAG in anti-GST. WCL so bili testirani z IB z anti-V5, anti-HA, anti-FLAG in anti-actin. c, Vezava HA-označenega MDA5 ali RIG-I na V5-označenega SCoV2– PLpro ali FLAG-označenega MeV-V (pozitivna kontrola) v prehodno transfektiranih celicah HEK293T, določeno s HA ​​PD in IB z anti-V5 ali anti-FLAG in anti-HA. WCL so bili testirani z IB z anti-V5 in anti-FLAG. d, Oligomerizacija FLAG–MDA5–2CARD v celicah HEK293T, ki so bile sočasno transfektirane z vektorjem ali V5-označenim SCoV2 PLpro WT ali Cys111Ala 24 ur, ocenjeno z NativePAGE in IB z anti-FLAG. WCL so nadalje analizirali s SDS-PAGE in testirali z IB z anti-FLAG, anti-V5 in anti-actin. e, ISGilacija GST–MDA5–2CARD v celicah HEK293T, ki so izražale tudi FLAG–ISG15, HA–Ube1L in FLAG–UbcH8 in so bile 40 ur sotransfektirane z vektorjem ali označenim V5-označenim koronavirusom PLpro proteinov, določenih z GST PD in IB z anti-FLAG, anti-V5 in anti-GST. Podatki predstavljajo vsaj dva neodvisna poskusa s podobnimi rezultati.

Nato smo uporabili test zaščite pred virusi, ki eksperimentalno ločuje signalizacijo MDA5 v celicah, okuženih z virusom, od signalizacije IFNAR na nižji stopnji v istih celicah (slika 4e). Supernatanti iz z mutEMCV okuženih 'donorskih' celic, ki so bile bodisi si. C transfektirane ali osiromašene z ISG15 ali MDA5 so bile ultravijolične (UV) inaktivirane in nato prenesene na neokužene 'prejemne' celice. 'Pripravljene' prejemne celice so bile nato okužene z ZIKV, da bi neposredno spremljali protivirusni učinek proizvodnje IFN, posredovane z MDA5-, s strani donorskih celic. Medtem ko supernatanti iz si. 'Donorske' celice, transficirane s C, so močno zavirale replikacijo ZIKV, supernatanti iz knockdown celic ISG15 ali MDA5 pa so minimalno omejili okužbo z ZIKV (slika 4f). Podobno so supernatanti kulture iz donorskih celic, okuženih z EMCV, transficiranih z WT MDA5 skupaj s si. C je vodil do večje zaščite prejemnih celic pred virusnim izzivom kot tiste iz celic, ki izražajo WT MDA5 in osiromašene ISG15 (slika 4g). Skupaj ti podatki kažejo, da je ISGilacija pomembna za restrikcijo vrste virusov RNA, ki jo posreduje MDA5-.

Slika 6|SCoV2 PLpro zavira ISG15-posredovano signaliziranje MDA5 prek njegove aktivnosti de-ISGylase. a, RT-qPCR analiza transkriptov IFNB1, IFNL1, ISG15, MDA5 in RIG-I v NHLF, ki so bili transficirani z navedenimi siRNA za 40 h in nato transficirani z lažno RNA ali SCoV2 RNA (0,4 µg ml -1 ) 24 ur. b, Vezava SCoV2 Nsp3 na endogeni MDA5 v celicah A549–hACE2, ki so bile okužene s SCoV2 (MOI=0.5) 24 ur, določeno z IP z anti-MDA5 (ali kontrolo izotipa IgG), ki mu je sledil IB z anti-Nsp3 in anti-MDA5. WCL so bili testirani z IB z anti-Nsp3 in anti-aktinom. c, endogena MDA5 ISGilacija v celicah A549–hACE2, ki so bile lažno okužene ali okužene s SCoV2 (MOI=0.5) 40 ur v prisotnosti zaviralca PLpro (GRL-0617; 50 µM) ali nosilca kontrola (dimetilsulfoksid), določena z IP z anti-MDA5 (ali kontrolo izotipa IgG), ki ji sledi IB z anti-ISG15 in anti-MDA5. IB je preizkusil številčnost beljakovin IFIT1, RSAD2, ISG15 in aktina v WCL. Učinkovito replikacijo virusa je preveril IB z anti-Nsp3 in anti-Spike (S). d, analiza RT–qPCR transkriptov IFNB1, CCL5 in IFIT1 ter genomske RNA (gRNA) EMCV v celicah HeLa, ki so bile prehodno 24 ur transfektirane z vektorjem ali V5–SCoV2 PLpro WT ali mutanti in nato okužene z mutEMCV (MOI=0.5) 12 ur. e, titri EMCV v supernatantu celic RIG-I KO HEK293, ki so bile začasno 24 ur transfektirane z vektorjem ali FLAG–MDA5, skupaj z V5-označenim SCoV2 PLpro WT, Cys111Ala ali Arg166Ser/Glu167Arg, in nato okužene z EMCV (MOI=0.001) 16 ur, določeno s testom plakov. f, Številčnost beljakovin navedenih ISG v WCL iz poskusa v e, določena z IB z navedenimi protitelesi. Podatki predstavljajo vsaj dva neodvisna poskusa s podobnimi rezultati (povprečje ± sd n= 3 bioloških ponovitev v a, d in e). *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).

SCoV2 PLpro cilja na MDA5 za de-ISGilacijo.

Koronavirusi, kot so SARS-CoV (SCoV), MERS–CoV in nedavno nastali SCoV2, kodirajo PLpro, ki posreduje pri cepljenju virusnih poliproteinov33. Poleg tega ima PLpro dejavnosti deubikvitinacije in de-ISGilacije. Pred kratkim je bilo dokazano, da SCoV2 PLpro modulira protivirusne odzive predvsem prek svoje aktivnosti de-ISGylase15. Ker je znano, da je MDA5 glavni senzor za odkrivanje koronavirusov34,35, in ker so naši podatki pokazali, da je ISGilacija potrebna za omejitev virusa, ki jo posreduje MDA5-, smo preučili, ali SCoV2 PLpro encimsko odstrani MDA5 ISGilacijo, da antagonizira prirojeno imunost. SCoV2 PLpro WT, vendar ne njegov katalitično neaktivni mutant (PLpro Cys111Ala)15, je odpravil ISGilacijo GST–MDA5–2CARD in FLAG–MDA5 (sl. 5a, b in razširjeni podatki, sl. 6a). Mutanta PLpro Asn156Glu in Arg166Ser/Glu167Arg, ki sta obrobno in resno oslabljena pri vezavi ISG15 na vmesniku 'mesto 1', 14,36, sta rahlo ali ne vplivala na ISGilacijo. Nasprotno pa je PLpro Phe69Ala, pri katerem je vmesnik 'mesta 2', ki prednostno določa vezavo na ubikvitin, ne pa ISG15, moten14,36, zmanjšal ISGilacijo MDA5 tako močno kot WT PLpro (sl. 5a, b in razširjeni podatki, sl. 6a). ). SCoV2 PLpro pa ni zatrl vseprisotnosti RIG-I–2CARD (razširjeni podatki, slika 6b). Ugotovili smo, da je PLpro sodeloval posebej z MDA5, ne pa tudi z RIG-I, tako kot MeV-V, ki veže MDA5 in je služil kot kontrola37 (slika 5c). Nizke količine PLpro so zavirale signalizacijo z MDA5, ne pa tudi RIG-I, medtem ko so višje količine PLpro zavrle protivirusno signalizacijo z obema RLR (razširjeni podatki, slika 6c). To krepi MDA5 kot neposredno tarčo PLpro. De-ISGilacija IRF3 verjetno predstavlja zaviralni učinek, ki ga imajo višji odmerki PLpro na signalizacijo RLR 15,38. Pri preučevanju učinka PLpro na oligomerizacijo MDA5–2CARD je PLpro WT, vendar ne Cys111Ala, učinkovito blokiral oligomerizacijo MDA5–2CARD (slika 5d), kar kaže, da SCoV2 PLpro zavira tvorbo oligomera MDA5, odvisno od ISGilacije, s svojo encimsko aktivnostjo. Encimi PLpro sorodnih -koronavirusov, SCoV, MERS–CoV in mišjega virusa hepatitisa (MHV), kot tudi -koronavirusa HCoV-NL63 (NL63) so se prav tako vezali na in učinkovito zmanjšali ISGilacijo MDA5–2CARD (slika 5e). , kar kaže, da je antagonizem MDA5 s strani PLpro morda v veliki meri ohranjen med koronavirusi.

rastlina cistanche krepi imunski sistem

SCoV2 PLpro antagonizira ISG15-odvisno signalizacijo MDA5.

Nato smo ugotovili pomembnost signalizacije MDA5, odvisne od ISG15-, za indukcijo protivirusnih citokinov, ki jo izzove SCoV2. Ker je znano, da okužba s SCoV2 minimalno inducira IFN tipa I zaradi učinkovitih virusnih antagonizmov39, smo izolirali celotno RNA iz SCoV2-okuženih celic in jo nato ponovno transfektirali v celice, da bi spodbudili prirojeno imunsko signalizacijo. SCoV2 RNA, vendar ne RNA iz lažno obdelanih celic, robustno inducira transkripte IFN; vendar se je ta indukcija izrazito zmanjšala, ko sta bila ISG15 ali MDA5 utišana (slika 6a). Knockdown RIG-I ni negativno vplival na izražanje protivirusnega gena, ki ga je izzvala SCoV2 RNA, kar kaže, da SCoV2 RNA-PAMP primarno zaznava os ISG15-MDA5 (slika 6a).

Ugotovili smo, da je nestrukturni protein 3 SCoV2 (Nsp3), znotraj katerega leži PLpro, med pristno okužbo s SCoV2 zlahka sodeloval z endogenim MDA5 (slika 6b). Endogene ISGilacije MDA5 ni bilo mogoče zaznati v SCoV2-okuženih celicah, čeprav je virus sprožil izražanje ISG15; vendar sta bili v okuženih celicah, zdravljenih s specifičnim zaviralcem PLpro15, ISGilacija MDA5 in indukcija ISG navzdol močno okrepljeni (slika 6c), kar podpira predlog, da PLpro učinkovito zavira ISGilacijo MDA5 in signalizacijo med živo okužbo s SCoV2. Nato smo preučili učinek WT in mutantnega PLpro na aktivacijo endogenega MDA5 med okužbo z mutEMCV. V skladu z njihovim učinkom na ISGilacijo MDA5 (slika 5b in razširjeni podatki, slika 6a) sta SCoV2 PLpro WT in Phe69Ala preprečila indukcijo protivirusnega transkripta, medtem ko MDA5 Arg166Ser/Glu167Arg, podobno kot mutant Cys111Ala, ni vplival na izražanje protivirusnega gena (sl. 6d). V skladu s tem je bila replikacija mutEMCV okrepljena v celicah, ki izražajo PLpro WT ali Phe69Ala, vendar ne v celicah, ki izražajo PLpro Cys111Ala ali Arg166Ser/Glu167Arg (slika 6d). Podobno je WT PLpro, vendar ne mutant Arg166Ser/Glu167Arg ali Cys111Ala, blokiral omejitev EMCV s FLAG-MDA5 (slika 6e); učinek na replikacijo virusa je bil v korelaciji z induciranimi proteini ISG (slika 6f). Skupaj to vzpostavlja SCoV2 PLpro kot antagonist IFN, ki aktivno de-ISGilira MDA5.

Diskusija

Znano je, da konjugacija ISG15 daje protivirusno aktivnost številnim virusom; vendar je bilo identificiranih le nekaj pristnih substratov12. Po drugi strani ISG15 v svoji nekonjugirani obliki deluje proviralno tako, da okrepi inhibicijo signala IFNAR, ki jo posreduje USP18-31,32,40. Ta študija opredeljuje ključno vlogo ISGilacije pri indukciji IFN, ki jo posreduje MDA5-. Naše delo prav tako poudarja pomen eksperimentalne zasnove, pri kateri je ločevanje vloge ISG15 pri aktivaciji MDA5 od tiste pri dušenju signalizacije IFNAR bistveno za razkritje močne protivirusne aktivnosti ISG15. V okuženem organizmu je verjetno vsota več dogodkov ISGilacije (ki vplivajo na gostiteljske in virusne beljakovine) tista, ki določa izid okužbe in patogenezo, ki je lahko odvisna od konteksta12.

Prednosti cistanche tubulosa- okrepiti imunski sistem

Naše ugotovitve kažejo, da ISGilacija MDA5 deluje podobno kot vseprisotnost RIG-I5, povezana z Lys63-: oba PTM (1) uravnava defosforilacija, ki jo povzroča PP1-, in (2) spodbujata oligomerizacijo CARD in višji RLR -naročanje sklopov. Medtem ko je ubikvitina veliko tako v neokuženih kot v okuženih celicah, se izražanje ISG15 močno poveča s stimulacijo IFN. Kljub temu je ISG15 celo na bazalnih ravneh konjugiran na številne gostiteljske proteine20, vključno z MDA5, kot je pokazalo naše delo, kar lahko zadostuje za začetno aktivacijo MDA5. Med virusnimi okužbami, ki jih zazna več PRR-jev, je lahko ISGilacija MDA5 "pripravljalni" mehanizem, pri katerem uravnavanje ISG15 s takojšnjim prirojenim senzorjem (na primer RIG-I)41 pripravi MDA5, da vstopi v način "zagona". Ker ISG15 negativno uravnava RIG-I16,17, lahko ISGilacija sproži 'preklapljanje senzorja', kjer se aktivacija MDA5 spodbuja, ko se ravni ISG15 povečajo, medtem ko se aktivnost RIG-I duši. Ugotovili smo, da SCoV2 PLpro antagonizira ISGilacijo MDA5 s svojo encimsko aktivnostjo po vezavi na senzor; ta strategija je verjetno ohranjena med koronavirusi, kar zahteva nadaljnjo preiskavo. Analize s krioelektronsko mikroskopijo so pokazale, da je koronavirusni Nsp3 del kompleksa por, ki obsega vezikle z dvojno membrano, pridobljene iz endoplazemskega retikuluma, in izvaža na novo sintetizirano virusno RNA42. Tako se lahko MDA5 postavi v neposredno bližino mesta izvoza virusne RNA, da olajša odkrivanje PAMP; vendar domena PLpro Nsp3 (ki je na citoplazemski strani) blokira signalizacijo MDA5 prek neposredne de-ISGilacije. Nekateri virusi lahko tudi zavirajo ISGilacijo MDA5 z disregulacijo fosforilacije MDA5, kot je prikazano za MeV-V. Če povzamemo, naša študija razkriva pomembno vlogo ISGilacije pri aktiviranju imunosti, ki jo posreduje MDA5-, kot tudi njeno inhibicijo s SCoV2, kar razkriva potencialno molekularno tarčo za načrtovanje terapevtikov proti COVID-19.

Reference

1. Liu, G. & Gack, MU Različne in orkestrirane funkcije senzorjev RNA pri prirojenih. Imuniteta 53, 26–42 (2020).

2. Wu, J. & Chen, ZJ Prirojeno imunsko zaznavanje in signalizacija citosolnih nukleinskih kislin. Annu. Rev. Immunol. 32, 461–488 (2014).

3. Chow, KT, Gale, M.Jr & Loo, YM RIG-I in drugi senzorji RNA v protivirusni imunosti. Annu. Rev. Immunol. 36, 667–694 (2018).

4. Schlee, M. Glavni senzorji patogenih RNA-RIG-I podobnih receptorjev. Imunobiologija 218, 1322–1335 (2013).

5. Rehwinkel, J. & Gack, MU RIG-I podobni receptorji: njihova regulacija in vloge pri zaznavanju RNA. Nat. Rev. Immunol. 20, 537–551 (2020).

6. Wies, E. et al. Defosforilacija RNA senzorjev RIG-I in MDA5 s fosfatazo PP1 je bistvena za prirojeno imunsko signalizacijo. Imuniteta 38, 437–449 (2013).

7. Gack, MU et al. TRIM25 RING-finger E3 ubikvitin ligaza je bistvena za protivirusno aktivnost, ki jo posreduje RIG-I. Narava 446, 916–920 (2007).

8. Chiang, C. & Gack, MU Post-translacijski nadzor intracelularnih poti zaznavanja patogenov. Trendi Immunol. 38, 39–52 (2017).

9. Lazear, HM, Scoggins, JW & Diamond, MS Skupne in različne funkcije interferonov tipa I in tipa III. Imuniteta 50, 907–923 (2019).

10. Schoggins, JW Z interferonom stimulirani geni: kaj vse počnejo? Annu. Rev. Virol. 6, 567–584 (2019).

11. Zhang, D. & Zhang, DE Z interferonom stimuliran gen 15 in protein ISGilacijski sistem. J. Interferon Cytokine Res. 31, 119–130 (2011).

12. Perng, YC & Lenschow, DJ ISG15 v protivirusni imunosti in več. Nat. Rev. Microbiol. 16, 423–439 (2018). 13. Hadjadj, J. et al. Oslabljeno delovanje interferona tipa I in vnetni odzivi pri bolnikih s hudo boleznijo COVID-19. Znanost 369, 718–724 (2020).

14. Klemm, T. et al. Mehanizem in inhibicija papainu podobne proteaze, PLpro, SARS-CoV-2. EMBO J. 39, e106275 (2020).

15. Shin, D. et al. Papainu podobna proteaza uravnava širjenje virusa SARS-CoV-2 in prirojeno imunost. Narava 587, 657–662 (2020).

16. Kim, MJ, Hwang, SY, Imaizumi, T. & Yoo, JY Regulacija negativne povratne informacije protivirusnega signaliziranja, ki ga posreduje RIG-I, s konjugacijo ISG15, ki jo povzroča interferon. J. Virol. 82, 1474–1483 (2008).

17. Du, Y. et al. LRRC25 zavira signalizacijo IFN tipa I tako, da cilja na RIG-I, povezan z ISG15-, za avtofagično razgradnjo. EMBO J. 37, 351–366 (2018).

18. Hato, SV et al. Vodilni protein mengovirusa blokira transkripcijo gena za interferon-alfa/beta in zavira aktivacijo regulacijskega faktorja interferona 3. Cell Microbiol. 9, 2921–2930 (2007).

19. Deddouche, S. et al. Identifikacija agonista MDA5, povezanega z LGP2-, v celicah, okuženih s pikornavirusom. eLife 3, e01535 (2014).

20. Durfee, LA, Lyon, N., Seo, K. & Huibregtse, JM. Sistem konjugacije ISG15 na široko cilja na novo sintetizirane proteine: posledice za protivirusno delovanje ISG15. Mol. Celica 38, 722–732 (2010).

21. Lenschow, DJ et al. Identifikacija z interferonom stimuliranega gena 15 kot protivirusne molekule med okužbo z virusom Sindbis in vivo. J. Virol. 79, 13974–13983 (2005).

22. Gack, MU, Nistal-Villan, E., Inn, KS, Garcia-Sastre, A. & Jung, JU Negativna regulacija protivirusne aktivnosti RIG-I, posredovana s fosforilacijo. J. Virol. 84, 3220–3229 (2010).

23. Nistal-Villan, E. et al. Negativna vloga fosforilacije serina 8 RIG-I pri uravnavanju proizvodnje interferona beta. J. Biol. Chem. 285, 20252–20261 (2010).

24. Maharaj, NP, Wies, E., Stoll, A. & Gack, MU Konvencionalna protein kinaza C-alfa (PKC-alfa) in PKC-beta negativno uravnavata transdukcijo protivirusnega signala RIG-I. J. Virol. 86, 1358–1371 (2012).

25. Davis, ME et al. Antagonizem fosfataze PP1 s proteinom V virusa ošpic je potreben za prirojeni imunski umik MDA5. Cell Host Microbe 16, 19–30 (2014).

26. Lin, JP, Fan, YK & Liu, HM Te 14-3-3eta chaperone protein spodbuja protivirusno prirojeno imunost s pospeševanjem oligomerizacije MDA5 in znotrajcelične prerazporeditve. Patog PLoS. 15, e1007582 (2019).

27. Wu, B. et al. Strukturna osnova za prepoznavanje dsRNA, tvorbo filamentov in aktivacijo protivirusnega signala z MDA5. Celica 152, 276–289 (2013).

28. Yu, Q., Qu, K. & Modis, Y. Cryo-EM strukture filamentov MDA5-dsRNA na različnih stopnjah hidrolize ATP. Mol. Celica 72, 999–1012 (2018).

29. Bruns, AM, Leser, GP, Lamb, RA & Horvath, CM Prirojeni imunski senzor LGP2 aktivira protivirusno signalizacijo z uravnavanjem interakcije MDA5–RNA in sestavljanja filamentov. Mol. Celica 55, 771–781 (2014).

30. Uchikawa, E. et al. Strukturna analiza vezave dsRNA na protivirusna receptorja za prepoznavanje vzorcev LGP2 in MDA5. Mol. Celica 62, 586–602 (2016).

31. Malakhova, OA et al. UBP43 je nov regulator signalizacije interferona, neodvisen od njegove aktivnosti izopeptidaze ISG15. EMBO J. 25, 2358–2367 (2006).

32. Zhang, X. et al. Človeški intracelularni ISG15 preprečuje čezmerno ojačanje interferona alfa/beta in avtovnetje. Narava 517, 89–93 (2015).

33. Harcourt, BH et al. Identifikacija produktov replikacije koronavirusa hudega akutnega respiratornega sindroma in karakterizacija aktivnosti proteaze, podobne papainu. J. Virol. 78, 13600–13612 (2004).

34. Roth-Cross, JK, Bender, SJ & Weiss, SR MDA5 prepozna mišji virus hepatitisa s koronavirusom in inducira interferon tipa I v možganskih makrofagih/mikrogliji. J. Virol. 82, 9829–9838 (2008).

35. Menachery, VD et al. Oslabitev in obnovitev mutanta koronavirusa hudega akutnega respiratornega sindroma brez aktivnosti 2'-O-metiltransferaze. J. Virol. 88, 4251–4264 (2014).

36. Bekes, M. et al. Prepoznavanje z Lys48-povezanim di-ubikvitinom in deubikvitinacijskimi aktivnostmi papainu podobne proteaze koronavirusa SARS. Mol. Celica 62, 572–585 (2016).

37. Childs, K. et al. mda-5, vendar ne RIG-I, je pogosta tarča za proteine ​​V paramiksovirusa. Virologija 359, 190–200 (2007).

38. Shi, HX et al. Pozitivna regulacija aktivacije regulatornega faktorja interferona 3 s Herc5 prek modifikacije ISG15. Mol. Cell Biol. 30, 2424–2436 (2010).

39. Blanco-Melo, D. et al. Neuravnotežen odziv gostitelja na SARS-CoV-2 spodbuja razvoj COVID-19. Celica 181, 1036–1045 (2020).

40. Speer, SD et al. Pomanjkanje ISG15 in povečana virusna odpornost pri ljudeh, vendar ne pri miših. Nat. Komun. 7, 11496 (2016).

41. Errett, JS, Suthar, MS, McMillan, A., Diamond, MS & Gale, M. Jr. Bistvene, neodvečne vloge RIG-I in MDA5 pri odkrivanju in nadzoru okužbe z virusom Zahodnega Nila. J. Virol. 87, 11416–11425 (2013).

42. Wolf, G. et al. Molekularna pora prekriva dvojno membrano replikacijskega organela koronavirusa. Znanost 369, 1395–1398 (2020).

43. Major, EO et al. Vzpostavitev linije glialnih celic človeškega ploda, ki podpira razmnoževanje virusa JC. Proc. Natl Acad. Sci. ZDA 82, 1257–1261 (1985).

44. Hertzog, J. et al. Okužba z brazilskim izolatom virusa Zika ustvari stimulatorno RNA RIG-I, virusni protein NS5 pa blokira indukcijo in signalizacijo IFN tipa I. EUR. J. Immunol. 48, 1120–1136 (2018).

45. Cerikan, B. et al. Celično intrinzična prilagoditev, ki izhaja iz kronične ablacije ključnega regulatorja rho GTPaze. Dev. Celica 39, 28–43 (2016).

46. ​​Chan, YK & Gack, MU Fosfomimetični mehanizem virusa denge za antagonizacijo prirojene imunosti. Nat. Immunol. 17, 523–530 (2016).

47. Riedl, W. et al. Virus Zika NS3 posnema celični 14-3-3-vezni motiv za antagonizacijo prirojene imunosti, ki jo posreduje RIG-I in MDA5-. Cell Host Microbe 26, 493–503 (2019).

48. Ulane, CM, Rodriguez, JJ, Parisien, JP & Horvath, CM Vseprisotnost STAT3 in razgradnja z virusom mumpsa zavirata signalizacijo citokinov in onkogena. J. Virol. 77, 6385–6393 (2003).

49. Oudshoorn, D. et al. HERC6 je glavna ligaza E3 za globalno konjugacijo ISG15 v mišjih celicah. PLoS ONE 7, e29870 (2012).

50. Kim, DK et al. Obsežna, prilagodljiva zbirka regij kodiranja SARS-CoV-2. G3 (Bethesda) 10, 3399–3402 (2020).

51. Chiang, C. et al. Onkoprotein humanega papiloma virusa E6 cilja na USP15 in TRIM25, da zavira prirojeno imunsko signalizacijo, ki jo posreduje RIG-I. J. Virol. 92, e01737-17 (2018).

52. Gack, MU et al. Vloge RIG-I N-terminalne tandemske kartice CARD in spojene različice pri TRIM25-posredovani protivirusni signalni transdukciji. Proc. Natl Acad. Sci. ZDA 105, 16743–16748 (2008).

53. Chiang, JJ et al. Virusno razkrivanje celičnih transkriptov psevdogena 5S rRNA inducira imunost, ki jo posreduje RIG-I. Nat. Immunol. 19, 53–62 (2018).

54. Sparrer, KMJ et al. TRIM23 posreduje z virusom povzročeno avtofagijo z aktivacijo TBK1. Nat. Microbiol. 2, 1543–1557 (2017).