Sočasna imunoterapija na osnovi liposomov z agonistom TLR in blokado kontrolne točke CD47-SIRP za učinkovito zdravljenje raka debelega črevesa

Povzetek:

Protitumorska imunost je bistvena sestavina zdravljenja raka in je primarno posredovana s prirojenim imunskim odzivom, ki ima ključno vlogo pri sprožitvi in ​​oblikovanju adaptivnega imunskega odziva. Nastajajoči dokazi so identificirali prirojene imunske kontrolne točke in receptorje za prepoznavanje vzorcev, kot sta CD47 in Toll-like receptor 7 (TLR7), kot obetavne terapevtske tarče za zdravljenje raka. Na podlagi fuzijskega proteina Fc-CV1, ki obsega varianto SIRP z visoko afiniteto (CV1), in Fc fragmenta človeškega protitelesa IgG1, smo izkoristili pripravek, ki je povezal Fc-CV1 z liposomi, obremenjenimi z imikvimodom (agonist TLR7) ( CILP) za aktivno ciljanje na CT26. WT singeni modeli tumorja debelega črevesa. Študije in vitro so pokazale, da so CILP pokazali boljše lastnosti podaljšanega sproščanja in učinkovitost privzema celic v primerjavi s prostim imikvimodom. In vivo so testi dokazali, da so CILP-ji pokazali učinkovitejše kopičenje v tumorjih in pomembnejši učinek supresije tumorja kot kontrolne skupine. Ta pripravek za imunoterapijo je imel prednosti nizkih odmerkov in nizke toksičnosti. Ti rezultati so pokazali, da lahko kombinacija terapije z blokado imunske kontrolne točke (ICB) in agonistov prirojene imunosti, kot sta Fc-CV1 in liposomski pripravek, napolnjen z imikvimodom, uporabljen v tej študiji, predstavlja zelo učinkovito strategijo za zdravljenje tumorjev.

Prednosti cistanche tubulosa-Antitumor

Ključne besede:

imikvimod; liposom; Fc-CV1; imunoterapija; rak debelega črevesa

1. Uvod

Globalna pojavnost raka še naprej vsako leto narašča, kar resno ogroža zdravje svetovnega prebivalstva in predstavlja veliko breme za zdravstvene sisteme. Po poročilu Svetovne zdravstvene organizacije je bilo leta 2020 po vsem svetu 19,29 milijona novih primerov raka in 9,96 milijona smrti zaradi raka [1]. Vendar pa sta se z nenehnim napredkom v klinični diagnostiki, kirurgiji, radioterapiji in kemoterapiji splošno preživetje in kakovost življenja bolnikov z rakom znatno izboljšala. Predvsem imunoterapija, ki izvira iz cepiva Coley v 1890-ih [2], je pred radioterapijo in kemoterapijo in je v zadnjem desetletju dosegla pomemben napredek, kar je koristilo bolnikom z rakom.

Imunoterapija tumorjev je bila priznana zaradi odlične biokompatibilnosti in visoke specifičnosti ter je sposobna inducirati imunske odzive za odstranitev tumorskih celic [3–5]. Dve glavni strategiji za imunoterapijo tumorjev sta krepitev imunosti in normalizacija imunosti [6]. Vzorci krepitve imunskega sistema so v glavnem sestavljeni iz terapije s citokini, cepiv za zdravljenje tumorjev in monoklonskih protiteles. Toll-like receptorji (TLR) veljajo za potencialne tarče za imunoterapijo raka zaradi njihove vloge pri aktivaciji prirojenega imunskega sistema. Agonisti TLR so bili razviti kot imunski adjuvans in številni agonisti TLR so v kliničnih preskušanjih [7]. Monofosforilni lipid A in imikvimod, agonisti TLR4 oziroma TLR7 so ​​prejeli odobritev Uprave za hrano in zdravila za klinično uporabo [7–9]. Imikvimod, agonist TLR7 [9], aktivira imunski odziv in poveča protitumorsko delovanje s sprožitvijo TLR7 [10,11]. Strategijo imunske normalizacije predstavljajo zdravila za blokado imunske kontrolne točke (ICB), ki uravnavajo okvarjen adaptivni tumorski imunski odziv. Odkar je bil prvi zaviralec kontrolne točke, ipilimumab, odobren za klinično uporabo v ZDA leta 2011, so zaviralci imunske kontrolne točke, kot so zaviralci PD1/PDL1, naredili preboj v imunoterapiji raka [12–14]. Razen prilagojenih imunskih kontrolnih točk, podobnih PD1/PDL1, so tudi nekatere prirojene imunske kontrolne točke, kot je SIRP -CD47, pritegnile veliko pozornosti in postale področja, ki so zelo zanimiva pri razvoju zdravil protiteles [15–17].

Kontrolna točka SIRP -CD47 je bila prvič identificirana leta 1999 [18,19]. SIRP je receptor CD47, izražen v nevronih centralnega živčnega sistema [20] in mieloidnih celicah, vključno z monociti, makrofagi, granulociti in dendritičnimi celicami. CD47 je "samooznačevalna molekula", izražena na skoraj vseh normalnih celicah in prekomerno izražena na večini tumorskih celic [21]. Na površini tumorskih celic se CD47 veže na SIRP in zavira fagocitozo, posredovano z makrofagi, ki je pomembno sredstvo za imunski pobeg tumorja [22]. Pokazalo se je, da se lahko fagocitoza makrofagov znotraj tumorskega mikrookolja poveča, ko je vezava CD47 in SIRP blokirana [20–25]. Zato so bili razviti in uporabljeni pri zdravljenju raka [26] zaviralci imunskih kontrolnih točk, ki blokirajo pot CD47/SIRP.

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

Kliknite tukaj za ogled izdelkov Cistanche Enhance Imunity

【Vprašajte za več】 E-pošta:cindy.xue@wecistanche.com/Whats App: 0086 18599088692/Wechat: 18599088692

V tej študiji smo za zdravljenje raka debelega črevesa uporabili kombinacijo imikvimoda in fuzijskega proteina (Fc-CV1). CV1 je modificiran humani rekombinantni protein SIRP, ki ima 50,000-krat večjo afiniteto za CD47 kot originalni protein [27]. Fc-CV1 je bil konstruiran s tehnologijo "Knobs-into-holes", ki temelji na monomeru CV1 in Fc fragmentu humanega IgG1. Da bi premagali omejitve slabe terapevtske učinkovitosti in sistemske toksičnosti, povezane z imikvimodom [28, 29], smo pripravili nanoliposome z metodo vbrizgavanja etanola. Nanoliposomi imajo značilnosti nizke toksičnosti pri dostavi zdravil [30,31]. Nato so imikvimod inkapsulirali v liposome, ki so površinsko konjugirali Fc-CV1. Končno lahko ta novi nano-pripravek aktivno dostavi agoniste TLR7 v tumorska tkiva in ima dvojno funkcijo kot zdravilo ICB in agonist TLR. Uporabili so ga za zdravljenje modela singenega tumorja debelega črevesa CD47+ CT26.WT [32].

2. Rezultati in razprava

2.1. Karakterizacija LP (prazni liposomi), ILP (ciljni liposomi, inkapsulirani z imikvimodom brez CD47-), CLP (ciljni liposomi, usmerjeni na CD47) in CILP (spojeni liposomi, obremenjeni s Fc-CV1 na imikvimod (agonist TLR7))

CILP so bili uspešno pripravljeni z vbrizgavanjem etanola in gradientno metodo amonijevega sulfata. Slika 1A prikazuje postopek sinteze CILP. Analiza TEM je pokazala, da so bili CILP sferični in enotne oblike (slika 1B). Poleg tega je rezultat DLS razkril, da je bila velikost delcev štirih liposomov unimodalna porazdelitev (slika 1C). Hitrost vezave (BR) je bila preverjena s SDS-PAGE, ki je prikazana na sliki 1D, E. Slika 1D prikazuje molekulsko maso Fc-CV1 in relativno svetlost pasu dializiranih in preddializiranih CILP. BR je bil izračunan na 67,13 ± 37,10 % s skeniranjem denzitometrije elektroforetskih pasov Image J (slika 1E), kar zagotavlja možnost, da CD47-cilja tumorske celice.

Slika 1. (A) Shematski prikaz sinteze CILP. (B) TEM slika CILP

HPLC je bil uporabljen za odkrivanje učinkovitosti inkapsulacije (EE) imikvimoda (dodatna slika S1). Kot je prikazano na dodatni sliki S1A, je prosti imikvimod pokazal pomemben posamezen vrh, medtem ko CLP niso pokazali vrha pod enakimi preskusnimi pogoji (dodatna slika S1B). Zato je mogoče zaznati CILP neposredno pod preskusnimi pogoji. Kot je bilo pričakovano, so bile vrednosti zaznavanja CILP pred in po dializi obravnavane kot skupna vsebnost zdravila oziroma vsebnost zdravila v liposomih (dodatna slika S1C, D). EE imikvimoda je bil izračunan na 85,44 ± 4,11 %. V primerjavi s prijavljenim sistemom za dostavo zdravil s pasivnim nalaganjem [33–35] je ta študija dosegla večjo učinkovitost inkapsulacije in udobnejši postopek priprave.

DLS je pokazal, da so bili premeri LP 111,567 ± 0.655 nm, medtem ko so CLP, ILP in CILP pokazali nekoliko večjo velikost 117.467 ± 0.34{{10} } nm, 120.233 ± 0.776 nm oziroma 13{{30}}.033 ± 0,974 nm (tabela 1). Spremembe v velikosti teh liposomov lahko pripišemo modifikaciji Fc-CV1 in imikvimoda. PDI je bil blizu 0,1 (tabela 1), kar kaže, da so bila ta vozila za dostavo zdravil zelo homogena v svoji porazdelitvi. Poleg tega so bile izmerjene vrednosti zeta-potenciala za LP, CLP, ILP in CILP –2,231 ± 0,167 mV, –2,492 ± 0,033 mV, –2,383 ± 0,070 mV oziroma –2,075 ± 0,070 mV (tabela 1) , kar kaže, da sta imela površinsko konjugiran Fc-CV1 in inkapsuliran imikvimod majhen učinek na naboj liposomov.

Tabela 1. Premeri, zeta-potencial, PDI in EE za LP, CLP, ILP in CILP.

2.2. Učinkovitost privzema celic in vitro

Učinkovitost privzema celic CILP je bila ovrednotena z intenzivnostjo fluorescence Cy5, ki so jo prevzele celice CT26.WT, z uporabo sistema za slikanje z visoko vsebnostjo. Kot je prikazano na sliki 2, so v primerjavi s prostimi skupinami Cy5 in ILP-Cy5 skupine CILPs-Cy5 po 30 minutah inkubacije pokazale močnejšo zmogljivost privzema celic. Ti rezultati sklepajo, da je Fc-CV1 povečal sposobnost znotrajcelične dostave liposomov, obremenjenih z imikvimodom, zaradi specifične afinitete do receptorja Fc-CV1, kar vodi do močnejšega protitumorskega učinka.

Slika 2. Slike celic CT26.WT po inkubaciji s prostim Cy5, ILPs-Cy5 in CILPs-Cy5 (rdeče) 0.5 h in obarvanju z DAPI (modro). Merilna vrstica: 50 µm. (n {{10}}). * p < 0,05; **** p < 0,0001

2.3. Krivulje sproščanja liposomov

Krivulje sproščanja zdravila prostega imikvimoda, ILP in CILP so bile izmerjene v simuliranem in vivo okolju. Slika 3 prikazuje, da se je prosti imikvimod v celoti sprostil po 1 uri, medtem ko je bila stopnja sproščanja (RR) imikvimoda, inkapsuliranega z ILP in CILP, le 54,75 ± 4.08 % in 39,70 ± 0,05 % po 12 urah. , oz. Poleg tega bi lahko počasno sproščanje imikvimoda v ILP in CILP zaprli z lastnostjo nadzorovanega sproščanja zdravil liposomov. RR imikvimoda pri ILP in CILP ni pokazal pomembne razlike po 96 urah, kar kaže, da je imel "po vstavitvi" zanemarljiv vpliv na stabilnost membrane liposomov.

slika 3. Krivulje sproščanja imikvimoda prostega imikvimoda, ILP in CILP v PBS pri 37 ◦C. Podatki so predstavljeni kot srednje vrednosti ± standardni odklon (n=3). * p < 0.05, ** p < 0,01

2.4. Študija citotoksičnosti

Za preučevanje citotoksičnosti CILP in vitro je bil na celicah CT26.WT izveden test CCK{{0}}. Kot je prikazano na sliki 4, CILP pri nizkih koncentracijah (0,1–1 µg/mL) niso pokazali citotoksičnosti, kar je skladno z varnostjo imunizacijske terapije. Viabilnost celic se je nekoliko zmanjšala po zdravljenju z imikvimodom v odmerku 5 µg/ml, verjetno zaradi imunogene celične smrti, ki jo povzroča ROS in endoplazmatski retikulum, induciran z imikvimodom [36]. Poleg tega CILP povzročijo znatno zmanjšanje viabilnosti celic v primerjavi s kontrolnimi skupinami, kar pripisujejo sinergističnemu učinku imikvimoda in Fc-CV1.

Slika 4. Viabilnost celic, zdravljenih s Fc-CV1, imikvimodom, CLP, ILP in CILP 24 ur. Koncentraciji Fc-CV1 in imikvimoda sta bili 0–10 µg/mL. * p < 0.05, ** p < 0,01, ns=ni pomembnih razlik

2.5. Študija biodistribucije

Porazdelitev in kopičenje različnih formulacij v tumorjih in večjih organih neposredno vpliva na terapevtski učinek. Po intravenskem dajanju smo fluorescenčne signale spremljali z uporabo skoraj infrardečega vivisekcijskega sistema, da bi ocenili porazdelitev in kopičenje različnih formulacij v tumorjih in večjih organih po 24 urah. Kot je prikazano na sliki 5, je bila skupna intenzivnost fluorescence ILPs-Cy5 in CILPs-Cy5 višja od prostega Cy5, kar kaže, da so imeli liposomi lastnost dolgotrajnega kroženja in vivo. Poleg tega je bila intenzivnost fluorescence terapevtske skupine CILPs-Cy5 najvišja v tumorskem tkivu, kar bi lahko pripisali ciljnemu učinku ligandov Fc-CV1 na tumor, s čimer se je okrepil protitumorski učinek. Presenetljivo je, da je bila intenzivnost fluorescence jeter in vranice močnejša od drugih organov, kar je verjetno posledica fagocitoze liposomov s strani retikuloendotelnega sistema (RES) v jetrih in ledvicah [37].

Slika 5. Porazdelitev Cy5-fluorescence v tumorjih in večjih organih 24 ur po intravenskem dajanju. Podatki so prikazani kot srednje vrednosti ± standardni odklon (n=3). **** p < 0.0001

2.6. In vivo študija inhibicije tumorja

Terapevtski razpored (slika 6A) in učinki različnih pripravkov so prikazani na sliki 6. V primerjavi s skupinama PBS in LP so druge skupine zdravljenja pokazale določene učinke zaviranja tumorja. Predvsem je bil volumen tumorja minimalen po zdravljenju s CILP, kar kaže, da so imeli CILP odličen učinek zaviranja tumorja (slika 6B).

Slika 6. (A) Shematski prikaz zdravljenja proti raku debelega črevesa na tumorskem modelu CT26.WT. (B) Krivulje rasti volumna tumorja med obdobjem zdravljenja. (C) Relativne fotografije tumorja in (D) teža tumorja, zbranih iz različnih zdravljenih skupin na dan 17. (E) Razmerje relativne telesne teže in telesne teže v primerjavi z 0 dnevom. Podatki so predstavljeni kot povprečje ± standardni odklon (n=5). * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001.

Na koncu poskusa so miši žrtvovali in jim izrezali tumorje, jih fotografirali in stehtali, da bi ugotovili terapevtsko učinkovitost različnih pripravkov. Kot je prikazano na sliki 6C, D, je imela zdravljena skupina CILP najmanjše in najlažje tumorje v primerjavi z drugimi skupinami, kar dokazuje, da so imeli CILP največje učinke zaviranja tumorjev. Tabela 2 kaže, da je stopnja inhibicije rasti tumorja za CILP izračunana na 84,35 %. Poleg tega je bila 84,35-odstotna stopnja supresije tumorja bistveno višja kot pri skupinah CLP in ILP, kar pomeni, da obstaja sinergistični učinek blokade osi "ne jej me" in aktivacije imunskega odziva. . V primerjavi z enakovrednim pripravkom in vitro (2,5–5 µg/ml) je bila višja stopnja inhibicije tesno povezana s stopnjo imunskega odziva, aktiviranega s formulacijo, in je blokirala mehanizem imunskega umika in vivo, ki ni bil na voljo in vitro.

Tabela 2. Podatki o teži tumorja in zaviranju rasti tumorja (TGI) različnih zdravljenih skupin.

2.7. CILP Povečana infiltracija T-celic in izločanje IFN

Da bi raziskali okolje imunskih celic tumorjev, smo na koncu protitumorskega testa imunohistokemično analizirali imunsko celico, inducirano s CILP. CD4+ in CD8+ T celice so bile povečane v tumorskih delih skupin CILPs (slika 7). Sočasno dajanje Fc-CV1 in terapije z imikvimodom je povzročilo znatno infiltracijo celic T CD4+ in CD8+. Poleg tega je prišlo do pomembnega izločanja IFN v tumorjih, ki so bili zdravljeni s CILP, kar je bilo zato, ker so CILP sprožili Tollu podoben receptor 7 in aktivirali imunski odziv.

Slika 7. Imunohistokemija tkiv mišjega tumorja; pozitivne celice so obarvane rjavo. Lestvica merila, 50 µm (n=5).

2.8. Ocena biološke varnosti CILP

Biološka varnost terapije, posredovane s CILP, je bila prav tako pomemben indeks v smislu dostopa do terapevtske ocene. Med študijo inhibicije tumorja in vivo CILP niso povzročili pomembne izgube teže v obdobju zdravljenja (slika 6D). Vsi biokemični parametri jeter in ledvic so bili v normalnem območju glede na standardno referenčno območje miši (tabela 3), histologija organa pa ni pokazala pomembnih sprememb, kar kaže, da so imeli CILP odlično biološko varnost (slika 8). Te ugotovitve so ključne pri ocenjevanju potenciala CILP kot varnega in učinkovitega imunoterapevtskega sredstva za zdravljenje raka.

Tabela 3. Biokemični parametri jeter in ledvic

Slika 8. H&E (hematoksilin in eozin) barvanje glavnih organov. Lestvica, 50 µm (n=3)

3. Materiali in metode

3.1. Materiali

Imikvimod je bil kupljen pri MedChem Express (Šanghaj, Kitajska). Fc-CV1 je zagotovil Državni ključni laboratorij za protitelesna zdravila in tarčno terapijo. Holesterol, hidrogenirani lecitin (HSPC), DSPE-PEG2000, DSPE-PEG2000-NHS in DSPE-PEGCy5 so bili kupljeni pri Xi'an Ruixi Biological Technology Co., Ltd. (Xi'an, Kitajska). 40,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) je bil pridobljen pri Keygen Biotech (Nanjing, Kitajska). Amonijev sulfat je bil pridobljen pri Sinopharm (Šanghaj, Kitajska). Metanol (kromatografska kakovost) in acetonitril (kromatografska kakovost) sta bila kupljena pri podjetju Aladdin Reagent Company (Šanghaj, Kitajska). Vsi drugi reagenti so domače analitske stopnje. Mišja celična linija raka debelega črevesa CT26. WT je zagotovila Cell Bank Kitajske akademije znanosti. Celice smo gojili v celičnem inkubatorju v mediju RPMI 1640, ki je vseboval 10 % FBS (Thermo Fisher Scientific, New York, NY, ZDA) pri 5 % CO2 in 95 % zraka. Samice miši BALB/c, stare 4–6 tednov, je dobavil Pengyue Laboratory Animal Breeding Co., Ltd. (Jinan, Kitajska).

3.2. Priprava praznih liposomov

Najprej je bilo 13,455 mg HSPC, 4,3595 mg DSPE-PEG2000 in 4,7095 mg holesterola natančno stehtanih in raztopljenih v 0,1 ml etanola (HSPC: DSPE-PEG2000:holesterol=55).5: molsko razmerje 5,05:39,3). Drugič, raztopino etanola smo hitro vbrizgali v predhodno segreto raztopino amonijevega sulfata (250 mM, 1 mL, 65 °C) preko brizge in nato inkubirali 30 minut pri 65 °C z magnetnim mešanjem. Nato smo pripravljeno raztopino zaporedno ekstrudirali skozi polikarbonatne membrane (Avanti, Alabaster, AL, ZDA); velikost je bila 200 nm, 100 nm oziroma 50 nm. Končno je nastala raztopina slepih liposomov (LP) s koncentracijo lipidov 22,5 mg/mL.

3.3. Priprava CD47 ciljno usmerjenih imikvimod-inkapsuliranih liposomov

Najprej smo DSPE-PEG2000-NHS raztopili v ddH2O (60 ◦C) in nato zmešali s Fc-CV1 ter inkubirali v stresalni mizi pri sobni temperaturi 5 ur (Fc-CV1:DSPEPEG2000- molsko razmerje NHS=12:1). Mehanizem kemijske reakcije povezave med Fc-CV1 in DSPE-PEG2000-NHS je vključeval reakcijo estra NHS s primarnim aminom na Fc-CV1 in tvoril konjugat namizne aminske vezi. Pripravljeno raztopino smo sorazmerno zmešali z LP in inkubirali pri 60 ◦C 1 uro, da smo Fc-CV1 vstavili v liposome, kar smo poimenovali "post insertion" [38]. Razmerja zmesi so bila, da je bilo 2,25 mg Fc-CV1 spremenjeno na 22,5 mg liposomov. Nato so bili pridobljeni CD47 ciljni liposomi (CLP).

Nato smo CLP dali v dializno vrečko (300 kDa) in 1 uro dializirali proti HEPES (10 mM, pH=7.4), da smo odstranili amonijev sulfat in preostali Fc-CV1 v zunanji vodni fazi. Dializirane CLP smo inkubirali z raztopino imikvimoda (5 mg/ml) v razmerju 1 mg proti 7 µmol skupnih fosfolipidov pri sobni temperaturi 24 ur in nato trikrat dializirali proti PBS (300 kDa), da smo odstranili neinkapsuliran imikvimod, ki se nanaša na tehnika gradienta amonijevega sulfata [39]. Nato so bili pridobljeni CILP-ji. Poleg tega so bili pripravljeni ne-CD47-ciljni liposomi, inkapsulirani z imikvimodom (ILP). CLP in ILP so veljali za kontrolo za CILP.

3.4. Karakterizacija

Morfologijo teh liposomov smo fotografirali s transmisijskim elektronskim mikroskopom (TEM, Joel, Tokio, Japonska). Velikost, zeta-potencial in indeks polimerne disperznosti (PDI) teh liposomov so bili določeni z dinamičnim sipanjem svetlobe (DLS) in elektroforetskim sipanjem svetlobe (ELS) z uporabo Malvernovega Zeta sizerja ZSE (Malvern, UK). Hitrost vezave (BR) Fc-CV1, vstavljenega v liposome, je bila izmerjena z elektroforezo v 15-odstotnem natrijevem lavrilsulfat-poliakrilamidnem gelu (SDS-PAGE) in programsko opremo Image J (Bethesda, MD, ZDA). Učinkovitost inkapsulacije (EE) imikvimoda je bila odkrita s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC, Thermo Fisher Scientific, New York, NY, ZDA).

Prednosti cistanche tubulosa-Antitumor

3.5. Študija privzema celic in vitro

Celični privzem teh liposomov in vitro je bil določen s kumulativno intenzivnostjo fluorescence Cy5 v CT26. WT celice. DSPE-PEG-Cy5 smo inkubirali s CILP in ILP (masno razmerje DSPE-PEG-Cy5: CILP ali ILP=1:5) pri 60 ◦C 1 uro, nato pa s fluorescenčnimi liposomi imenovani CILPs-Cy5 in ILPs-Cy5. Celice CT26.WT so bile posejane v 96-plošče z vdolbinicami in naključno razdeljene v tri skupine (1 × 104 celic/vdolbinico, n=3). Potem ko je celična konfluentnost dosegla 50–70 %, je bila vsaka skupina inkubirana s prostim Cy5, ILPs-Cy5 oziroma CILPs-Cy5 30 minut pri 37 ◦C, pri čemer so bile končne koncentracije Cy5 1 µg/mL v 0,1 ml medija RPMI 1640. Nato so bile celice imobilizirane s 4% paraformaldehidom 15 minut po dvakratnem izpiranju s PBS in nato obarvane z 10 µL DAPI (1 µg/µL) 10 minut po dvakratnem izpiranju s PBS. Končno je bil vnos vsake skupine celic zabeležen s sistemom za slikanje z visoko vsebnostjo (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, ZDA) po dvakratnem pranju s PBS.

3.6. Študija sproščanja imikvimoda

Krivulje sproščanja različnih z zdravilom obremenjenih liposomov so bile izvedene z dializno metodo (300 kDa) in rezultati primerjani s prosto raztopino imikvimoda. Na kratko, 0.6 ml ILP, CILP in raztopina imikvimoda so bili ločeno zapakirani v dializne vrečke in nato dani v 500 ml raztopine PBS (pH=7.4, 37 ◦C). Iz vrečk smo v vnaprej določenih časovnih intervalih (0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 48, 72 in 96 h) ekstrahirali enake količine vzorcev, hitrost sproščanja (RR) pa imikvimoda je bil izračunan z naslednjo enačbo:

kjer sta Sund in Sd predstavljala površino vrha HPLC imikvimoda v preddializiranih in dializiranih pripravkih ob različnih časih (n=3).

3.7. Citotoksičnost CILP

Celice CT{{0}}.WT smo zasejali v 96-ploščo z vdolbinicami (1 × 104/vdolbinico, n=3) in gojili v 100 µL medija RPMI 1640 do konfluence skoraj dosegel 70 %. Da bi določili citotoksičnost CILP, smo medij RPMI 1640 odstranili iz vsake vdolbinice in ga nadomestili s kompleksno raztopino CILP in medija RPMI 1640 s koncentracijami Fc-CV1 in imikvimoda v razponu od 0 do 10 µg/mL. Celice smo inkubirali s kompleksno raztopino 24 ur. Poleg tega so celice, ki so bile obdelane s Fc-CV1, CLP, raztopino imikvimoda in ILP v podobni koncentraciji, veljale za kontrolne skupine. Preživele celice so bile odkrite s testom CCK-8 po 24 urah, viabilnost neobdelanih celic pa je veljala za 100 %.

3.8. Študija biodistribucije

Devetim samicam miši BALB/c je bilo subkutano injicirano CT26. Celice WT (5 × 105) na desnem boku in te miši s tumorjem so bile naključno razdeljene v tri skupine (n=3). Volumen tumorja smo izmerili s čeljustjo in izračunali po naslednji formuli:

Ko je volumen tumorja dosegel 100 mm3, so intravensko injicirali prosti Cy5, ILP-Cy5 in CILPs-Cy5 v odmerku Cy5 0,4 mg/kg. Štiriindvajset ur po intravenski injekciji so odstranili tumor, srce, jetra, vranico, pljuča in ledvico. Fluorescenčne signale tumorjev in glavnih organov je zaznal sistem za optično slikanje IVIS (IVIS Lumina LT III, PerkinElmer, Waltham, MA, ZDA).

3.9. In vivo študija inhibicije tumorja

Petintrideset samic miši BALB/c je bilo naključno razdeljenih v sedem skupin (n=5) in 5 × 105 CT26. Celice WT so bile subkutano injicirane v desni bok vsake miši. Ko je bila velikost mišjega tumorja približno 100 mm3, se je začelo zdravljenje. PBS, LP, imikvimod, Fc-CV1, ILP, CLP in CILP so bili intravensko injicirani 0., 4., 8. in 12. dan. Odmerek imikvimoda je bil 2,5 mg/kg pri prvi in ​​drugi injekciji ter 5 mg/kg pri tretji in četrti injekciji. Pri vseh injekcijah je bil odmerek Fc-CV1 5 mg/kg. Pri tem odmerku je bila koncentracija zdravila v telesu 2,5–5 µg/mL, kar je v in vitro poskusu povzročilo citotoksičnost celic. Med zdravljenjem so vsak dan merili premer tumorja in telesno težo. 17. dan so mišjim tumorjem vzeli ven in izmerili njihovo težo. Inhibicija rasti tumorja (TGI) je bila izračunana po naslednji formuli:

3.10. Imunohistokemija

Imunohistokemijsko obarvanje CD4, CD8 in IFN je bilo izvedeno v tumorskih tkivih po standardnem protokolu. Po deparafinizaciji in rehidraciji parafinskega odseka odsekov tumorskih tkiv smo v krog dodali 3% BSA, da smo pokrili tkivo, in ga nato zapečatili 30 minut pri sobni temperaturi. Odseke smo čez noč obarvali s protitelesi CD4, CD8 in IFN (Servicebio, Wuhan, Kitajska) pri 4 ◦C in nato 50 minut inkubirali s sekundarnim protitelesom (označeno s HRP, Servicebio, Wuhan, Kitajska) pri sobni temperaturi. po dveh pranjih s PBS. Na koncu so bili odseki vizualizirani pod mikroskopom (Nikon, E100, Tokio, Japonska) po reakciji s kromogenim sredstvom DAB.

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

3.11. Ocena biološke varnosti CILP

Na koncu študije inhibicije tumorja so bili zbrani vsi tumorji in izmerjena teža teh tumorjev. Biokemične parametre, vključno z alanin transaminazo (ALT), aspartat transaminazo (AST), kreatininom (CREA) in sečnino (UREA), so odkrili v krvi miši. Sveža tumorska tkiva in glavni organi so bili fiksirani s 4% paraformaldehidom in vdelani v parafin z uporabo stroja za vdelovanje (Wuhan Junjie Electronics, JB-P5, Wuhan, Kitajska). Rezine tkiva z debelino 5 µm smo prerezali skozi mikrotom (Leica Instrument, RM2016, Šanghaj, Kitajska) in nato obarvali s hematoksilinom in eozinom (H&E) v skladu s protokolom. Nato so rezine za barvanje opazovali pod mikroskopom (Nikon, E100, Tokio, Japonska).

3.12. Statistična analiza

Vsi podatki so izraženi kot povprečje ± SD. Raven pomembnosti med skupinami je bila testirana z enosmerno ANOVA z uporabo Graphpad Prism 8.0.2. p < 0.05 je bilo opredeljeno kot pomembna razlika.

3.13. Živalska etika

Vse postopke in priporočila v zvezi z živalmi je odobril Posebni odbor za etiko znanstvenih raziskav Univerze Liaocheng v skladu z nacionalnimi smernicami za nego in uporabo laboratorijskih živali (koda odobritve: 2022111010; datum odobritve: 1. november 2022).

rastlina cistanche krepi imunski sistem

4. Sklepi

Če povzamemo, ciljno usmerjeni liposomi CD47-, inkapsulirani v imikvimod, so bili uspešno razviti, rezultati in vitro pa so dokazali, da imajo CILP boljše podaljšano sproščanje in specifični ciljni učinek. Rezultati in vivo so pokazali, da lahko pripravek učinkovito sprejmejo tumorske celice in da je pokazal odlično učinkovitost zdravljenja tumorja in biološko varnost zaradi dvojne funkcije imunskega odziva in prirojene blokade imunske kontrolne točke. Zato se zdi, da so liposomi, inkapsulirani z imikvimodom, povezani s Fc-CV1, obetavna nova nanomedicina za izboljšanje zdravljenja tumorja z izražanjem CD47. Imunoterapija, ki temelji na prirojeni imunosti, lahko v prihodnosti služi kot splošna strategija proti rasti tumorja za sinergistične kombinacije z ICB.

Reference

1. Sung, H.; Ferlay, J.; Siegel, RL; Laversanne, M.; Soerjomataram, I.; Jemal, A.; Bray, F. Global Cancer Statistics 2020: Globocan ocene incidence in umrljivosti po vsem svetu za 36 rakov v 185 državah. CA Cancer J. Clin. 2021, 71, 209–249. [CrossRef] [PubMed]

2. Carlson, RD; Flickinger, JC, Jr.; Snook, AE Talkin' Toxins: From Coleys to Modern Cancer Immunotherapy. Toksini 2020, 12, 241. [CrossRef] [PubMed]

3. Barbari, C.; Fontaine, T.; Parajuli, P.; Lamichhane, N.; Jakubski, S.; Lamichhane, P.; Deshmukh, RR Imunoterapije in kombinirane strategije za imunoonkologijo. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 5009. [CrossRef]

4. Hegde, PS; Chen, DS 10 največjih izzivov pri imunoterapiji raka. Imuniteta 2020, 52, 17–35. [CrossRef]

5. Jain, KK Personalizirana imunoonkologija. med. Princ. Prakt. 2021, 30, 1–16. [CrossRef]

6. Sanmamed, MF; Chen, L. Sprememba paradigme v imunoterapiji raka: od izboljšanja do normalizacije. Celica 2018, 175, 313–326. [CrossRef]

7. Husein, WM; Liu, TY; Skwarczynski, M.; Toth, I. Toll-Like Receptor Agonists: Patent Review (2011–2013). Strokovno mnenje. Ther. Pat. 2014, 24, 453–470. [CrossRef]

8. Chi, H.; Li, C.; Zhao, FS; Zhang, L.; Ng, TB; Jin, G.; Sha, O. Protitumorska aktivnost agonistov Toll-Like Receptor 7. Spredaj. Pharmacol. 2017, 8, 304. [CrossRef] [PubMed]

9. Wang, Y.; Zhang, S.; Li, H.; Wang, H.; Zhang, T.; Hutchinson, MR; Yin, H.; Wang, X. Modulatorji majhnih molekul Toll-like receptorjev. Acc. Chem. Res. 2020, 53, 1046–1055. [CrossRef] [PubMed]

10. Le Mercier, I.; Poujol, D.; Sanlaville, A.; Sisirak, V.; Gobert, M.; Durand, I.; Dubois, B.; Treilleux, I.; Marvel, J.; Vlah, J.; et al. Spodbujanje tumorja z intratumoralnimi plazmocitoidnimi dendritičnimi celicami se obrne z zdravljenjem z ligandom Tlr7. Cancer Res. 2013, 73, 4629–4640. [CrossRef]

11. Ma, F.; Zhang, J.; Zhang, J.; Zhang, C. Agonisti Tlr7 Imiquimod in Gardiquimod izboljšajo imunoterapijo na osnovi DC za melanom pri miših. Celica. Mol. Immunol. 2010, 7, 381–388. [CrossRef]

12. Billan, S.; Kaidar-Person, O.; Gil, Z. Zdravljenje po napredovanju v dobi imunoterapije. Lancet Oncol. 2020, 21, e463–e476. [CrossRef] [PubMed]

13. Darvin, P.; Toor, SM; Sasidharan Nair, V.; Elkord, E. Inhibitorji imunske kontrolne točke: nedavni napredek in potencialni biomarkerji. Exp. Mol. med. 2018, 50, 1–11. [CrossRef] [PubMed]

14. Li, B.; Chan, HL; Chen, P. Zaviralci imunske kontrolne točke: osnove in izzivi. Curr. med. Chem. 2019, 26, 3009–3025. [CrossRef] [PubMed]

15. Jia, X.; Yan, B.; Tian, ​​X.; Liu, Q.; Jin, J.; Shi, J.; Hou, Y. Pot Cd47/Sirpalpha posreduje pri imunskem pobegu proti raku in imunoterapiji. Int. J. Biol. Sci. 2021, 17, 3281–3287. [CrossRef]

16. Swoboda, DM; Sallman, DA Obljuba makrofagov usmerjenih zaviralcev kontrolnih točk pri mieloidnih malignomih. Najboljše prakse in raziskave. Clin. Haematol. 2020, 33, 101221.

17. Lentz, RW; Colton, MD; Mitra, SS; Messersmith, WA Zaviralci prirojene imunske kontrolne točke: naslednji preboj v medicinski onkologiji? Mol. Rak Ther. 2021, 20, 961–974. [CrossRef]

18. Jiang, P.; Lagenaur, CF; Narayanan, V. Protein, povezan z integrinom, je ligand za P84 nevronsko adhezijsko molekulo. J. Biol. Chem. 1999, 274, 559–562. [CrossRef]

19. Seiffert, M.; Cant, C.; Chen, Z.; Rappold, I.; Brugger, W.; Kanz, L.; Brown, EJ; Ullrich, A.; Buhring, HJ Človeški signalno-regulacijski protein se izraža na normalnih, vendar ne na podskupinah levkemičnih mieloidnih celic in posreduje pri celični adheziji, ki vključuje njegov protireceptor Cd47. Blood 1999, 94, 3633–3643. [CrossRef]

20. Matlung, HL; Szilagyi, K.; Barclay, NA; van den Berg, TK. Signalna os Cd47-Sirpalpha kot prirojena imunska kontrolna točka pri raku. Immunol. Rev. 2017, 276, 145–164. [CrossRef] [PubMed]

21. Oldenborg, PA; Železnjak, A.; Fang, YF; Lagenaur, CF; Gresham, HD; Lindberg, FP Vloga Cd47 kot označevalca samega sebe na rdečih krvnih celicah. Znanost 2000, 288, 2051–2054. [CrossRef]

22. Li, Z.; Li, Y.; Gao, J.; Fu, Y.; Hua, P.; Jing, Y.; Cai, M.; Wang, H.; Tong, T. Vloga imunske kontrolne točke Cd47-Sirpalpha pri imunskem izogibanju tumorju in prirojeni imunoterapiji. Life Sci. 2021, 273, 119150. [CrossRef]

24. Hajat, SMG; Bianconi, V.; Pirro, M.; Jaafari, MR; Hatamipour, M.; Sahebkar, A. Cd47: Vloga v imunskem sistemu in uporaba pri terapiji raka. Celica. Oncol. 2020, 43, 19–30. [CrossRef]

24. Huang, Y.; Ma, Y.; Gao, P.; Yao, Z. Ciljanje na Cd47: Dosežki in pomisleki trenutnih študij o imunoterapiji raka. J. Thorac. Dis. 2017, 9, E168–E174. [CrossRef]

25. Zhang, W.; Huang, Q.; Xiao, W.; Zhao, Y.; Pi, J.; Xu, H.; Zhao, H.; Xu, J.; Evans, CE; Jin, H. Napredek pri protitumorskih zdravljenjih, ki ciljajo na os Cd47/Sirpalpha. Spredaj. Immunol. 2020, 11, 18. [CrossRef] [PubMed]

26. Liu, X.; Pu, Y.; Cron, K.; Deng, L.; Kline, J.; Frazier, WA; Xu, H.; Peng, H.; Fu, YX; Xu, MM Blokada Cd47 sproži uničenje imunogenih tumorjev, posredovano s celicami T. Nat. med. 2015, 21, 1209–1215. [CrossRef] [PubMed]

27. Weiskopf, K.; Prstan, AM; Ho, CC; Volkmer, JP; Levin, AM; Volkmer, AK; Ozkan, E.; Fernhoff, NB; van de Rijn, M.; Weissman, IL; et al. Konstruirane različice Sirpalpha kot imunoterapevtski adjuvansi protitelesom proti raku. Znanost 2013, 341, 88–91. [CrossRef]

28. Xiong, Z.; Ohlfest, JR Lokalni imikvimod ima terapevtske in imunomodulatorne učinke proti intrakranialnim tumorjem. J. Immunother. 2011, 34, 264–269. [CrossRef]

29. Kamath, P.; Darwin, E.; Arora, H.; Nouri, K. Pregled terapije z imikvimodom in razprava o optimalnem upravljanju bazalnoceličnih karcinomov. Clin. Preiskava drog. 2018, 38, 883–899. [CrossRef]

30. Liu, Y.; Castro Bravo, KM; Liu, J. Ciljna liposomska dostava zdravil: perspektiva nanoznanosti in biofizike. Horiz na nanometru. 2021, 6, 78–94. [CrossRef] [PubMed]

31. Farjadian, F.; Ghasemi, A.; Gohari, O.; Roointan, A.; Karimi, M.; Hamblin, MR Nanofarmacevtski izdelki in nanozdravila, ki so trenutno na trgu: izzivi in ​​priložnosti. Nanomedicina 2019, 14, 93–126. [CrossRef]

32. Zhou, X.; Jiao, L.; Qian, Y.; Dong, Q.; Sonce, Y.; Zheng, W.; Zhao, W.; Zhai, W.; Qiu, L.; Wu, Y.; et al. Ponovno pozicioniranje azelnidipina kot dvojnega zaviralca, ki cilja na poti Cd47/Sirpalpha in Tigit/Pvr za imunsko terapijo raka. Biomolekule 2021, 11, 706. [CrossRef]

33. Ni, K.; Luo, T.; Culbert, A.; Kaufmann, M.; Jiang, X.; Lin, W. Nanoscale Metal-Organic Framework Co-Delivers Tlr{3}} Agonists and Anti-Cd47 Antibodies to Modulation Macrophages and Orchestra Cancer Immunotherapy. J. Am. Chem. Soc. 2020, 142, 12579–12584. [CrossRef]

34. Chen, Q.; Xu, L.; Liang, C.; Wang, C.; Peng, R.; Liu, Z. Fototermalna terapija z nanodelci imunskega adjuvanta skupaj z blokado kontrolnih točk za učinkovito imunoterapijo raka. Nat. Komun. 2016, 7, 13193. [CrossRef] [PubMed]

35. Wei, J.; Dolgo, Y.; Guo, R.; Liu, X.; Tang, X.; Rao, J.; Yin, S.; Zhang, Z.; Li, M.; He, Q. Večnamenska polimerna kemoimunoterapija na osnovi micelov z blokado imunske kontrolne točke za učinkovito zdravljenje ortotopičnega in metastatskega raka dojke. Acta Pharm. greh B 2019, 9, 819–831. [CrossRef]

36. Huang, JZ; Wang, ST; Chang, SH; Chuang, KC; Wang, HY; Kao, JK; Liang, SM; Wu, CY; Kao, SH; Chen, YJ; et al. Imikvimod ima protitumorske učinke z induciranjem imunogene celične smrti in je okrepljen z glikolitičnim zaviralcem 2-deoksiglukozo. J. Raziskovanje. Dermatol. 2020, 140, 1771–1783.e6. [CrossRef] [PubMed]

37. Wang, B.; On, X.; Zhang, Z.; Zhao, Y.; Feng, W. Presnova nanomaterialov in vivo: krvni obtok in čiščenje organov. Acc. Chem. Res. 2013, 46, 761–769. [CrossRef]

38. Akhtari, J.; Rezayat, SM; Teymouri, M.; Alavizadeh, SH; Gheybi, F.; Badiee, A.; Jaafari, Ciljanje na MR, karakterizacija biodistribucije in zaviranja rasti tumorja pri spajanju afiteles proti Her2 na liposomski doksorubicin z uporabo miši Balb/C, ki nosijo tumorje Tubo. Int. J. Pharm. 2016, 505, 89–95. [CrossRef]

39. Woodle, MC; Papahadjopoulos, D. Priprava liposomov in karakterizacija velikosti. Metode Enzymol. 1989, 171, 193–217. [PubMed]